Summary
In deze paper presenteren we een methode voor het transplanteren van menselijke stamcellen in verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van de kip embryo. Dit zorgt voor een
Abstract
De kip embryo is een klassiek diermodel voor het bestuderen van een normale embryonale en foetale ontwikkeling en voor xenotransplantatie experimenten om het gedrag van cellen te bestuderen in een gestandaardiseerde
Protocol
1. Het kweken van menselijke stamcellen en de voorbereiding voor injectie in embryo's
- Menselijke stamcellen worden gebruikt als voorbeeld in dit protocol (hersenen, adipose, beenmerg) zijn geïsoleerd op verschillende manieren uit de verschillende weefsels. Bijvoorbeeld, zijn volwassen neurale stamcellen geïsoleerd uit weefsel stukken verzameld uit de ventriculaire wand van de hersenen tijdens endoscopische neurochirurgie, die vervolgens gedissocieerd om individuele cellen die zijn gekweekt in vitro. De neurale stamcellen spontaan vorm neurospheres die zweven in het kweekmedium, terwijl andere celtypes te houden aan de bodem van de schaal 7. Vet-afgeleide mesenchymale stamcellen worden verkregen uit liposuctie materiaal dat enzymatisch is verteerd en spande zich in om vezelig weefsel te verwijderen en vervolgens gecentrifugeerd om te rijpen vetcellen te verwijderen. De resulterende cellen worden geresuspendeerd in kweekmedium aangevuld met serum om de proliferatie van stamcellen te bevorderen ten opzichte van andere celtypes 8 hematopoietische stamcellen en stamcellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg zuigt door positieve selectie door middel van specifieke antilichamen geconjugeerd aan magnetische deeltjes (Myltenyi Biotec, Duitsland of Dynal-Invitrogen, USA) en magnetische cel scheiding, en / of met behulp van antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen en fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 9.
- Om later de identificatie, het etiket van de stamcellen te vergemakkelijken met een fluorescente marker voor de implantatie in kippen embryo's. Stamcellen kunnen worden gelabeld met een fluorescerende lipofiele kleurstoffen zoals DII (Invitrogen, USA) of PKH26 (Sigma, USA) met behulp van de leverancier aanbevolen protocollen tot kort voor implantatie, of, voor een permanent label met in wezen geen gevaar van besmetting van gastheercellen, ze kunnen worden getransduceerd met het gen voor een fluorescerend eiwit, zoals Green Fluorescent Protein, met behulp van lentivirale vectoren, terwijl nog in de cultuur 10.
- Protocollen voor de cultuur en de verspreiding van menselijke stamcellen variëren. Gedetailleerde protocollen is te vinden in de literatuur. In het kort, zijn bol-forming stamcellen meestal gekweekt in flessen, terwijl hechtende stamcellen worden meestal gekweekt in petrischalen (wat te vergemakkelijken tritureren bij het splitsen, zie hieronder), in de juiste medium. Voor het splitsen of de oogst, pellet bol-vormende cellen door 5 min centrifugeren bij 1200 en resuspendeer in de voorverwarmde trypsine / EDTA-oplossing voor niet meer dan 5 min bij 37 graden Celsius. Voor hechtende cellen van de trypsine / EDTA-oplossing toe te voegen aan de petrischaal, en vermaal aan het eind van 5 minuten. Beëindig de behandeling met trypsine door het toevoegen van Ca 2 +-bevattend medium, soms aangevuld met albumine. Voor het verwijderen van het trypsine / EDTA, centrifuge de cellen (5 min bij 1200), verwijder het supernatans, hersuspenderen in koude injectie voertuig (meestal medium of fosfaat-gebufferde zoutoplossing), en centrifugeer weer (5 min bij 1200). Verwijder het merendeel van deze supernatant en voorzichtig resuspendeer de cellen om een sterk geconcentreerde celsuspensie te creëren.
- Houd de opschorting van menselijke stamcellen in een kleine, bedekte flacon of microfugebuis op ijs tot enkele uren voorafgaand aan de injectie. Overleving in deze toestand kan celtype-afhankelijk zijn. De injectie voertuig moet worden geoptimaliseerd op basis van de eigenschappen van de cellen, met inbegrip van hun kleefkracht (bijvoorbeeld een low-Ca 2 + voertuig kan helpen bij het voorkomen klonteren) en weerstand tegen hypoxie en pH veranderingen.
2. Ei incubatie en voorbereiding
- Bewaar bevruchte eieren in een koelkamer (bijvoorbeeld: Termaks, Bergen, Noorwegen) bij 14-15 ° C voorafgaand aan de incubatie. Bij deze temperatuur ontwikkeling is aangehouden tot de incubatie begint. Bevruchte eieren worden opgeslagen gedurende meer dan ongeveer 10 dagen of bij lagere temperaturen hebben een lager tarief van de verdere ontwikkeling en overleving.
- Om herstart ontwikkeling, plaatst u de eieren in een vochtige, ventilatorbranders incubator (bijvoorbeeld: Binder, New York, VS) op 38-39 ° C, en uitbroeden totdat de gewenste stadium van ontwikkeling is bereikt (voor de enscenering, zie ref 11. ).
- Voor het openen van het ei, maak een luchtbel boven het embryo door het invoegen van een 18 gauge naald van de spuit door de eischaal (niet te diep om te voorkomen dat de dooier piercing) en het evacueren van 4 ml van albumine (Figuur A). Hierdoor ontstaat een drukval die binnen enkele minuten is vereffend door de toetreding van lucht door de poreuze schaal. Omdat de lucht komt het verzamelt op het hoogste punt in de schil, dus het scheiden van de embryo vanaf de binnenkant van de schelp.
- Dicht het gat gecreëerd door de naald met conventionele plastic tape.
3. Pulling glas micropipetten
- Trek de glazen micropipetten van borosilicaatglas (bijvoorbeeld 1.2mm OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) op een gewone elektrode trekker (bijvoorbeeld, Model P-2000, Sutter Instruments, USA). Pas de trekker instellingen micropipetten die een hoge ingangsweerstand hebben bij gebruik als microel verkrijgenectrodes. Tips moet ongeveer 1-1,5 cm lang. De assen kunnen worden gemarkeerd op 1 mm intervallen voor de berekening van uitgeworpen volumes.
- Breek de micropipet tips om een werkbare grootte door het buigen van hen met een pincet of duwen ze tegen een stevige ondergrond terwijl u onder een microscoop. De break moet zo gelijk mogelijk zijn rond de omtrek van het glas en de daaruit voortvloeiende binnendiameter aan het uiteinde moet de omvang van de cellen te gebruiken zonder dat het verstopt tegemoet te komen. Typisch een 20-30 micron binnendiameter werkt goed.
4. De voorbereiding van Fast Green kleurstof oplossing (contrasterende reagens)
- Bereid een 0,1% (w / v) oplossing van Fast groene kleurstof (Sigma-Aldrich, USA) door het oplossen in kip fysiologische zoutoplossing (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na- fosfaat, 5 mM HEPES, 11 mM glucose, pH 7,4).
- Filter de Fast 'groene oplossing' door een 0,22 pm Millex GP filter (Millipore Co, Bedford, USA).
5. Het openen van de eieren en contrasterende het embryo
- Leg twee stukken tape op de bovenkant van het ei, die de afmetingen van de luchtzak. Houden van het ei georiënteerd, zodat het opgenomen gebied (en dus de luchtbel) bovenste is, snijd een klein venster binnen de grenzen van het opgenomen gebied met behulp van een stevige schaar dissectie. De tape voegt ondersteuning en helpt voorkomen dat eierschaal fragmenten uit vallen op het embryo. Luchtbellen in verband met de lucht pocket kan worden geknald met behulp van de back-end van een plastic pipet tip of andere stomp sonde.
- Teken een aantal snel groen oplossing in een 1 ml spuit met een 25 gauge naald. Verwijder eventuele luchtbelletjes in de spuit en de naald. Buig de naald een hoek van 45 graden, binnen te dringen op een punt buiten de embryonale plaat (geïdentificeerd door de ring van bloedvaten, dat het te omschrijven; piercing in de embryonale plaat verhoogt sterfte) en voorzichtig het borduren gids onder het embryo. Injecteer de kleurstof tot het gewenste contrast is bereikt. Het embryo, die normaal transparant is, moet nu uit staan als een witachtige spook tegen de donkergroene kleur (Figuur B). Veel onderzoekers gebruiken India Ink (verdund tot 10% v / v) in plaats van Fast Green. In dit geval is het belangrijk om India Ink, dat is niet giftig, zoals Pelikan Fount India Ink.
6. Het maken van achterhersenen en het ruggenmerg neurale buis laesies
- Produceren aangescherpt wolfraam naalden door de vlam-etsen kort (2-3 cm) stukken van 100 micrometer diameter wolfraam stang (catalogusnummer 719000, A & R Systems, Seattle, Washington), met een acetyleen / zuurstof toorts. Dit wordt gedaan door het uiteinde van de stang heel kort in de fakkel vlam tot er een vonk is gezien, die de explosieve erosie van de buitenste lagen van wolfraam vertegenwoordigt, met achterlating van een scherpe punt.
- Met behulp van een geslepen wolfraam naald, slice door en buigen van de vitelline membraan dat het gebied voor microchirurgie.
- Met behulp van een seconde scherper wolfraam naald (de punt van de eerste naald is vaak beschadigd na het snijden door het vitelline membraan en niet geschikt voor de volgende microchirurgie), snijd voorzichtig door het epitheel van de bovenliggende neurale buis en het af te buigen, dan knippen rond en onder het stuk van de neurale buis moet worden verwijderd, met korte, snelle opwaartse bewegingen (Figuur C). Het maken van de dwarse sneden en vervolgens in de lengterichting snijdt is meestal het meest succesvol. Niet gesneden te diep of loopt u het risico doordringen onderliggende bloedvaten, die typisch is fataal.
- Voorzichtig flip of sleep de verwijderde weefsel stuk weg van de laesie site met de wolfraam naald. Als dit moeilijk blijkt, kan het ook worden verwijderd door de mond zuigen met een glazen micropipet aan flexibele slang.
7. Injectie van menselijke stamcellen
a. Injectie in een laesie van de neurale buis
Teken een kleine hoeveelheid cellen in het uiteinde van een glazen micropipet via de mond zuigen met behulp van een plastic buis. De werking concentratie van de celsuspensie moet worden geoptimaliseerd voor de cel type dat moet worden geïnjecteerd. Monteer de micropipet op een micromanipulator en sluit deze aan een microinjector pomp (bijvoorbeeld: PV830 Pneumatische PicoPump, WPI, Washington, USA). Onder visuele controle met behulp van een dissectie microscoop, begeleiden de micropipet tip in de laesie en zorgvuldig de cellen te verdrijven door het verhogen van de luchtdruk (hetzij door pulsen van constante druk of door het geleidelijk opvoeren van de druk) (Figuur C). Wanneer de gewenste hoeveelheid cellen wordt afgezet binnen de laesie site, zorgvuldig te trekken van de micropipet.
b. Injectie in het lumen van de neurale buis
In sommige gevallen kan het wenselijk zijn om cellen te injecteren in de zich ontwikkelende hersenen ventrikels, bijvoorbeeld als de cellen invasieve genoeg zijn om de toegang tot de neurale weefsel te krijgen in de afwezigheid van laesies. Injectie van cellen in het lumen van een brain regio vereist het gebruik van een ontwikkelingsfase waarin de lumen zorgt voor een voldoende grote opvangbak en is gemakkelijk bereikbaar; HH stadia 12 tot 18 positief in dit opzicht. Een laesie is niet nodig. Gewoon doorboren de wand van de neurale buis met het glas micropipet voorafgaand aan de injectie van cellen. De belangrijkste elementen voor het succes van deze methode zijn de scherpte van de micropipet en het abrupte karakter van de penetratie, te langzaam een beweging en de micropipet tip kan de neurale buis muur alleen kuiltje zonder doordringend.
c. Systemische injectie
Systemische injecties kan worden gemaakt via de extra-embryonale bloedvaten (vanaf HH stadium 15, wanneer deze vaartuigen goed ontwikkeld zijn). Dit is niet zelden gepaard met een aantal bloeden en omdat er veel kleine slagaders en minder grotere aderen, intra-arteriële injecties zijn over het algemeen veiliger als het gaat om het voortbestaan van de embryo's. Aan de andere kant, intraveneuze injecties snellere toegang van de cellen naar het hart en dus waarschijnlijk een meer gelijkmatige verdeling van de cellen. Een succesvolle injectie vraagt om een scherpe micropipet met een diameter kleiner dan gepland het schip. Benadering van het schip langs de as onder een kleine hoek van de horizontale (ongeveer 30 graden). Duw de micropipet tegen het schip tot het vaartuig begint af te sluiten om. Dan verder duwen in een bedrijf, abrupte beweging te dringen. Trek langzaam tot het bloed wordt gezien door de capillaire werking te trekken in de punt van de micropipet. Injectie van de cellen moet dan worden uitgevoerd met constante druk, waarna het micropipet is ingetrokken met een snelle beweging.
8. Het afdichten van de ei
- Na de injectie, laat het ei nog steeds staan voor een paar minuten, zodat de geïnjecteerde cellen zich te vestigen en houden. Om uitdroging te voorkomen (die snel kan optreden en kan fataal zijn), leg een stukje vochtig tissue of filtreerpapier over het venster tijdens deze rustperiode.
- Na een paar minuten en de cellen hebben zich gevestigd, droog de schil rond het venster en sluit het venster met de conventionele plastic tape. Zorg ervoor dat dit zegel strak is en dat er geen albumine kan lekken door de opening of tussen het reservoir en de tape (dit vaak fataal tijdens daaropvolgende incubatie).
- Vervang de eieren aan de geforceerde ontwerp incubator voor verdere ontwikkeling. Observatie kan worden gemaakt met tussenpozen door het verwijderen van de tape over het raam.
9. Embryo dissectie
- Zodra het embryo de gewenste stadium, crack opent het ei in een kom ijskoud fysiologische zoutoplossing of met fosfaat gebufferde zoutoplossing (de tape op het raam moet eerst worden teruggebracht tot de twee helften van de eierschaal laten scheiden). De ijskoude zoutoplossing dient om het embryo te verdoven door onderkoeling. Het hart moet snel vertragen en stoppen binnen een paar minuten.
- Scheid de embryo uit de extra-embryonale membranen en het podium met behulp van ref. 11.
- Onthoofden het embryo, overbrengen naar een dissectie schotel die een siliconen rubber vloer en bevat zuurstofrijk fysiologische zoutoplossing aangevuld met glucose (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na-fosfaat, 5 mM HEPES, 11 mM glucose, pH 7,4) en speld het snel ventrale zijde naar boven. Verwijder de buik-en borstkas ingewanden. Met behulp van een haakse schaar, maken longitudinale incisies langs elke ventrolaterale aspect van de wervelkolom. Vooral in een later stadium (na 6 dagen van de ontwikkeling), is de eerste incisie beste gemaakt in de lumbosacrale regio waar de ruimte tussen de wervels en het ruggenmerg het grootst is. Verwijder het ventrale aspect van de wervelkolom naar het ruggenmerg zichtbaar te maken. Zorg ervoor dat de fysiologische zoutoplossing blijft zuurstof door borrelen op ongeveer 10-minuten met puur medische zuurstof.
- Knip voorzichtig de ontluikende dorsale en ventrale wortels aan beide zijden, transect het ruggenmerg op het gewenste niveau, en til het uit van het wervelkanaal. Het ruggenmerg zal overleven voor vele uren in deze staat en kan worden onderworpen aan anatomische en fysiologische 13,14 12 experimenten.
Figuur 1. A) De juiste aanpak voor evacuatie van albumine. Let op de positie van het embryo en de plaatsing van de naald. B) Contrasterende van het embryo. Let op de penetratie punt van de naald buiten de embryonale schijf. C) Schematische weergave van de procedure voor het eenzijdige spinale neurale buis letsel, gevolgd door stamceltransplantatie.
Discussion
De kip embryo is een handige en veelzijdige diermodel voor xenotransplantatie experimenten. Het ontbreken van een functioneel immuunsysteem tijdens de embryonale en foetale ontwikkeling maakt de overleving en ontwikkeling van cellen uit een soort dat de incubatie temperatuur tolereert. Kippenembryo's zijn gebruikt om het regeneratief potentieel van de verschillende soorten stamcellen (beoordeeld in ref. 15) te testen. Zoogdieren stamcellen kunnen integreren in kippenembryo weefsels waaronder het centrale zenuwstelsel, waar ze kunnen aanleiding geven tot neuronen die axonale projecties, kan synaptische connectiviteit en elektrofysiologische eigenschappen worden beoordeeld in het kader van functionele neurale circuits 1,2.
Omdat de chirurgische ingrepen zijn relatief eenvoudig, en injecties worden gemaakt onder visueel in plaats van stereotaxische controle, kan het aantal embryo's eenvoudig worden verhoogd tot verschillende experimentele condities in een enkel experiment tegemoet te komen. Typisch cellen kunnen worden geïnjecteerd in 20 tot 30 embryo's in een 4-uur experiment. De post-injectie sterfte van de embryo's is de belangrijkste beperkende factor. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om bloedingen en uitdroging te voorkomen. Wees ervan bewust dat er bepaalde kritische ontwikkelingsstadia waarin de natuurlijke sterfte toeneemt. Aanvulling van het embryo met een paar ml van de warme, gesteriliseerde kip bel na injectie en de dag voordat kritische ontwikkelingsstadia, evenals ervoor te zorgen dat het venster in het ei is goed afgesloten en gericht om te voorkomen dat lekkage, verbetert de overleving. Indien lekkage door de beschermstrook dient plaats te vinden, verwijdert u de tape, droog het oppervlak en de re-tape. Sommige onderzoekers gebruik van wax en glas of plastic dekglaasjes om het venster te sluiten. De sterfte mag niet worden aanzienlijk van elkaar verschillen geïnjecteerd versus sham bediende embryo's.
Hoewel we hier gericht op de injectie van menselijke stamcellen in de Anlage van de hersenen en het ruggenmerg, kunnen stamcellen worden geïnjecteerd in de Anlage van andere organen (zie bijvoorbeeld ref. 4). Elk orgaan stelt zijn eigen uitdagingen. Bijvoorbeeld, kan een injectie in het hart een uitdaging zijn vanwege de hoge mechanische weerstand tegen penetratie pipet en door bewegingen, die aan de andere kant kan worden vertraagd door het koelen van de embryo's op kamertemperatuur voorafgaand aan de injectie. Organen die een lumen gebrek mag niet geschikt voor de injectie van voldoende volumes en kan daarom een chirurgische laesie aan een stopcontact te creëren. In onze ervaring, post-laesie weefselregeneratie is een voordeel, omdat het bevordert de integratie van de menselijke stamcellen in het weefsel. Cellen kunnen ook worden geïnjecteerd in de embryonale mesenchym, zoals het verspreiden somitic mesenchym of de migrerende neurale lijst als een manier om opname te realiseren in de mesenchymale derivaten, waaronder neurale lijst afgeleid perifere ganglia 16,17.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door subsidies van Helse og Rehabilitering (JLB), De Noorse Research Council (GH en GAG) en de Universiteit van Oslo (NK en GAG).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Sigurjonsson, O. E., Perreault, M. C., Egeland, T., Glover, J. C. Adult human hematopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 5227-5232 (2005).
- Pochampally, R. R., Neville, B. T., Schwarz, E. J., Li, M. M., Prockop, D. J. Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9282-9285 (2004).
- Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells to the chick embryo. Methods Mol. Biol. 331, 137-151 (2006).
- Lee, H., Shamy, G. A., Elkabetz, Y., Schofield, C. M., Harrsion, N. L., Panagiotakos, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Wichterle, H., Peljto, M., Nedelec, S. Xenotransplantation of embryonic stem cell-derived motor neurons into the developing chick spinal cord. Methods Mol. Biol. 482, 171-183 (2009).
- Westerlund, U., Svensson, M., Moe, M. C., Varghese, M., Gustavsson, B., Wallstedt, L., Berg-Johnsen, J., Langmoen, I. A. Endoscopically harvested stem cells: a putative method in future autotransplantation. Neurosurgery. 57, 779-784 (2005).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol. Biol. 325, 35-46 (2006).
- Smeland, E. B., Funderud, S., Kvalheim, G., Gaudernack, G., Rasmussen, A. M., Rusten, L., Wang, M. Y., Tindle, R. W., Blomhoff, H. K., Egeland, T. Isolation and characterization of human hematopoietic progenitor cells: an effective method for positive selection of CD34+ cells. Leukemia. 6, 845-852 (1992).
- Zhang, X. Y., La Russa, V. F., Bao, L., Kolls, J., Schwarzenberger, P., Reiser, J. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol. Ther. 5, 555-565 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88 (1), 44-92 (1951).
- Glover, J. C. Retrograde and anterograde axonal tracing with fluorescent dextrans in the embryonic nervous system. Neuroscience Protocols. 30, 1-13 (1995).
- O'Donovan, M. J., Bonnot, A., Mentis, G. Z., Arai, Y., Chub, N., Shneider, N. A., Wenner, P. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Mendelson, B., Frank, E. Specific monosynaptic sensory-motor connections form in the absence of patterned neural activity and motoneuronal cell death. J. Neurosci. 11, 1390-1403 (1991).
- Glover, J. C., Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N. Chimeric Animal Models in Human Stem Cell Biology. ILAR Journal. 51, 62-73 (2009).
- Lee, G., Kim, H., Elkabetz, Y., Al Shamy, G., Panagiotakos, G., Barberi, T., Tabar, V., Studer, L. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Jiang, X., Gwye, Y., McKeown, S. J., Bronner-Fraser, M., Lutzko, C., Lawlor, E. R. Isolation and characterization of neural crest cells derived from in vitro differentiated human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 18, 1059-1070 (2008).
