人类干细胞异种移植到鸡胚

Summary

在本文中我们提出一个人类干细胞移植到鸡胚中央神经系统的各地区的方法。这提供了一个

Abstract

鸡胚是研究胚胎和胎儿的正常发展，为异种器官移植实验的经典动物模型来研究细胞的行为，在一个标准化的

Protocol

1。分离和培养成胚胎的人类干细胞注射的准备

1. 作为在本议定书中的例子（脑，脂肪，骨髓）的人类干细胞分离在不同的方式从不同的组织。例如，成体神经干细胞分离的脑室壁内镜神经外科，然后分离单个细胞在体外培养的过程中收集的组织块。自发形成的神经干细胞神经球，漂浮在培养液中，而其他类型的细胞坚持底部的^菜 7 。脂肪间充质干细胞是从吸脂材料，是消化酶和紧张，以消除纤维组织，然后离心除去成熟的脂肪细胞。由此产生的细胞悬浮于培养基中血清补充，以促进干细胞的增殖，超过其他类型的^细胞 8造血干细胞和祖细胞可以从骨髓抽吸隔离使用特异性抗体标记的磁性粒子（Myltenyi生物技术，德国的积极选择或DYNAL - Invitrogen公司，美国）和磁性细胞分离和/或使用抗体的共轭荧光基团和荧光激活细胞分选^{（FACS）9。}
2. 为了便于以后识别，标签上的干细胞，用荧光标记的鸡胚胎植入前。干细胞可以被标记的亲脂性荧光染料，如使用DII（Invitrogen公司，美国）或PKH26供应商推荐的协议（美国Sigma公司）植入前不久，或为一个永久性标签，基本上没有污染宿主细胞的危险，他们可以像绿色荧光蛋白的荧光蛋白基因转导，利用慢病毒载体，而仍然^在文化10。
3. 不同的文化和传播人类干细胞的协议。文献中可以找到详细的协议。简言之，球造血干细胞通常在烧瓶中培养，而贴壁干细胞通常在培养皿中培养（方便trituration分裂时，见下文），在合适的介质。分裂或收割，颗粒球形成细胞在1200RPM和重悬5分钟不超过5分钟在37摄氏度预热胰蛋白酶/ EDTA溶液的离心。对于贴壁细胞的胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养皿中，并在5分钟后磨碎。终止加入的Ca ^{2 +}含中等，有时补充白蛋白的胰蛋白酶。要去除胰蛋白酶/ EDTA，离心机的细胞在1200RPM（5分钟），取出上清液，悬浮在寒冷的注射车辆（通常是中等或磷酸盐缓冲液），再离心（5分）在1200RPM。删除这最上清，轻轻悬浮细胞，以创建一个高度集中的细胞悬液。
4. 保存在一个小的，加盖的瓶或离心管放在冰上几个小时在注射之前，人类干细胞的悬浮液。在这种状态下的生存可能会依赖细胞类型。根据细胞的属性注射车辆必须进行优化，包括他们的附着性（如^低的Ca ² +车辆可能有助于防止结块）和抗缺氧和pH值的变化。

2。卵孵化和准备

1. 商店受精鸡蛋在冷却室（例如：Termaks，卑尔根，挪威），在14-15 ° C之前孵化。在此温度下的发展被逮捕开始，直到孵化。超过10天左右或在较低温度下储存的受精卵率较低的后续发展和生存。
2. 重新初始化发展的鸡蛋放在一个加湿，强制通风孵化器（例如：粘结剂，纽约，美国）在38-39 ° C，并孵化，直到达到所需的发展阶段（为分期，见文献11。 ）。
3. 打开鸡蛋前，通过蛋壳（不太深，以避免刺入蛋黄）中插入一个18针的注射器针头和疏散4毫升的白蛋白创建一个以上的胚胎的空气袋（图A）。这将创建一个压降，在几分钟内的空气通过多孔的外壳进入扳平。由于空气的进入，它收集在壳体内的最高点，因此，从外壳的内表面分离胚胎。
4. 与传统的塑料胶带密封注射器针头创建孔。

3。拉玻璃微量

1. 拉从高硼硅玻璃玻璃微量（例如，1.2毫米外径× 0.94 mm内径，传统的电极拉马（例如，美国哈佛大学器械），模型P - 2000，美国），萨特仪器。调整拉拔器设置，以获得具有高输入电阻时，microel使用的微量ectrodes。提示应约1-1.5厘米长。轴可以被标记在1 mm间隔计算卷弹出。
2. 打破弯曲用钳，他们或推动对固体表面，在显微镜下观察时，一个可行的大小微量提示。突破应尽量均匀左右的玻璃的周边和由此产生的尖端内径应适应不堵塞细胞的大小。 20-30微米内径通常效果很好。

4。快速绿色染料溶液（对比试剂的制备）

1. 准备的快速绿色染料（Sigma - Aldrich公司，美国）的0.1％（W / V）溶液溶解在鸡生理盐水（137毫米氯化钠，氯化钾5毫米，2毫米_氯化钙 2，1毫米_氯化镁 2，1毫米娜磷酸，5毫米HEPES，11毫米葡萄糖，pH值7.4）。
2. 通过0.22微米Millex GP过滤器（Millipore公司有限公司，百福，美国）的过滤器快速的绿色解决方案。

5。开放的鸡蛋和对比胚胎

1. 广场上的鸡蛋的顶部两片磁带，涵盖空气口袋的尺寸。保持鸡蛋为主，所以，录音的面积（气囊）最重要的是，切一个小窗口内的录音使用一个坚固的解剖剪刀面积边界。磁带增加了支持，并有助于防止蛋壳碎片坠落到胚胎。与气囊相关的气泡可以使用塑料枪头或其他钝探头后端弹出。
2. 绘制成一个用25号针头的1 ml注射器一些快速的绿色解决方案。取下注射器和针头在任何气泡。弯曲的针，一个45度角，渗透在胚胎板外的点（确定由血管circumscribe环;穿出内的胚胎板增加死亡率）和精心指导下胚胎的绒绣。注入的染料，直到达到所需的对比度。胚胎，这通常是透明的，现在应该站出来作为一个对深绿色（图B）白色的幽灵。许多研究者使用墨汁（稀释到10％V / V），而不是快速绿色。在这种情况下，重要的是，使用印度墨水是无毒的，如伯利坎润版液印度墨水，。

6。制作后脑和脊髓神经管病变

1. 生产削尖的钨针，火焰短（2-3厘米）件的直径为100微米的钨棒（目录号719000，A＆R的系统，西雅图，华盛顿），蚀刻与乙炔/氧气的火炬。这样做是很简单的杆端插入火炬的火焰，直到一个火花看到，它代表的钨外层的爆炸性的侵蚀，留下锋利的尖。
2. 通过使用一个削尖的钨针，片和偏转卵黄膜覆盖面积显微。
3. 使用第二个削尖的钨针（往往是破坏后的第一针的尖端通过卵黄膜切片，不适合随后的显微外科），仔细切割通过上皮覆神经管和偏转，然后切周围和下一块神经管被删除，使用短，见效快向上招（图C）。横向削减和纵向削减通常是最成功的。切不要过深或穿透底层的血管，这通常是致命的的危险。
4. 轻轻翻转或切除的组织块拖到远离病变的部位使用的钨针。如果这被证明是困难的，它也可以被删除，使用软管连接到一个玻璃微吸管吸口。

7。人类干细胞注射

A.注入病变神经管

绘制成的提示使用塑料管的玻璃微吸管口吸少量的细胞。被注入的细胞类型的细胞悬液浓度必须优化。安装在一个显微的微管，并把它连接到一个微量泵（例如：PV830气动PicoPump，WPI的，华盛顿，美国）。在解剖镜下使用的视觉控制，引导到病灶的微量的提示，并仔细驱逐增加空气压力（恒压脉冲或逐渐增加的压力）（图C）的细胞。当沉积在病变部位所需的细胞量，仔细撤回的微量。

B.神经管的管腔注入

在某些情况下，它可能是可取的细胞注入到发育中的大脑脑室，例如，如果细胞侵入神经组织病变的情况下获得的访问。细胞注射到任何BR流明AIN地区需要使用管腔提供一个足够大的插座，很容易进入的发展阶段; HH阶段12日至18日在这方面有利。的病变，是没有必要的。只需皮尔斯的神经管与玻璃微管细胞注射前的墙上。这种方法的成功的关键要素是微量渗透唐突的清晰度;太慢了一个运动和微量提示可能只有酒窝神经管内壁无穿透。

C.全身注射

全身注射液可通过多余的胚胎血管（HH阶段15起，当这些船只发达）。这是不寻常的陪同一些出血，因为有很多的小动脉和少数较大静脉，动脉注射一般都更安全，当涉及到胚胎的生存。另一方面，静脉注射到心脏细胞提供更快的访问，从而可能更均匀分布的细胞。一个成功的注入需要一个尖锐的微量直径小于目标船只。方法沿其轴线的水平（约30度）的一个小角度的船只。直到船只开始闭塞，对船只的微量推。然后推进一步坚定，突然运动渗透。慢慢地缩回，直到血液被看作是通过毛细作用绘制成的微尖。采用恒压，然后进行细胞注射后，微管是一个快速移动的缩回。

8。密封鸡蛋

1. 注射后，我们仍然允许注射的细胞来解决，坚持站在鸡蛋几分钟。以避免脱水（它可以很快发生，并能证明致命的），奠定了一块沾在窗口，在此期间的休息时间组织或滤纸。
2. 几分钟后，细胞纷纷落户，干在窗口的外壳，并与传统的塑料胶带密封的窗口。确保这种密封很紧，没有白蛋白可以通过开放或与壳体之间的磁带（这常常被证明是致命的，在随后的培养）的泄漏。
3. 更换蛋被迫草案孵化器的进一步发展。观察可以在窗口中删除磁带的时间间隔。

9。胚胎夹层

1. 一旦胚胎已经达到了预期的阶段，打开鸡蛋，一碗成一个冰冷的生理盐水或磷酸盐缓冲液（磁带覆盖窗口应削减首次允许分开的两半蛋壳）。冰冷的生理盐水，低温麻醉胚胎。心应迅速减缓，并在几分钟内停止。
2. 从胚外膜分离胚胎阶段，使用ref。 11。
3. 杀头的胚胎，其传输到一个清扫菜，硅橡胶地板，并包含含氧生理盐水辅以葡萄糖（137毫米氯化钠，氯化钾5毫米，2毫米_氯化钙 2，1毫米_氯化镁 2，1毫米的钠磷酸盐， 5 mM的HEPES，11毫米葡萄糖，pH值7.4）和针快腹侧。取下腹部和胸内脏。使用角度的剪刀，使纵切口，沿脊柱腹外每个方面。特别是在后期阶段（后发展6天），最初的切口是最好的腰骶椎骨和脊髓之间的空间是最大的地区。删除，脊柱揭示脊髓腹侧。确保生理盐水仍然由纯医用氧气在约10分钟一班冒泡含氧。
4. 小心剪去两边的新生的背，腹根，脊髓样所需的水平，并轻轻椎管。脊髓在这种状态下存活多小时，可承受¹²和生理解剖^13,14实验。

图1）疏散白蛋白适当的做法。请注意胚胎的位置和针的位置。二）对比的胚胎。胚胎光盘外，注意针的切入点。 c）过程的示意图表示单方面脊髓神经管病变细胞移植。

Discussion

鸡胚为异种器官移植实验的方便和灵活的动物模型。胚胎和胎儿发育期间缺乏免疫系统功能，允许从容忍任何种类的孵化温度的细胞的生存和发展。鸡胚胎已被用于测试各类干细胞（文献15）。的再生潜力。哺乳动物干细胞能够融入鸡胚胎组织，包括中枢神经系统，在那里他们可以引起神经元的轴突预测，突触连接和电生理特性，可以在功能^神经回路1,2的背景下进行评估。

由于手术过程中是比较容易的，注射是根据视觉，而不是立体控制，可以很容易地增加胚胎数量，以适应​​不同的实验条件，在一个单一的实验。通常情况下，细胞可以注入20-30胚胎在4小时的实验。注射后的胚胎死亡率是主要限制因素。必须采取预防措施，以避免出血和脱水。要知道，有某些关键的发展阶段自然死亡率增加。补充几毫升的温暖，鸡消毒振铃以下注射和关键发育阶段的前一天的胚胎，以及确保，鸡蛋中的窗口，是良好的密封和导向性，以避免泄漏，提高生存率。如果通过胶带密封泄漏发生，请取出磁带，干燥的表面，并重新磁带。一些研究者用蜡和玻璃或塑料盖玻片密封的窗口。死亡率不应与假手术胚胎注入大大不同。

虽然我们一直致力于人类干细胞注射到大脑和脊髓的原基的干细胞也可以被注入到其他器官原基（见4）例如文献。。各器官对自身的挑战。例如，注射入心可以是具有挑战性的，因为高的机械性能，吸管渗透和，因为运动，另一方面可以减缓冷却至室温，在注射之前，胚胎。机关缺乏流明可能无法容纳足够数量的注射，因此可能需要手术的病变，以创建一个插座。在我们的经验，后病变组织的再生是一个优势，因为它可以促进组织的人类干细胞的融合。如分散somitic间质的方式来实现纳入到间质的衍生工具，包括神经嵴衍生的外围神经^节 16,17或迁移的神经嵴的胚胎间质细胞也被注入。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation