Xenotransplantation av mänskliga stamceller i Chicken Embryo

Summary

I detta paper presenterar vi en metod för transplantation av mänskliga stamceller i olika regioner i centrala nervsystemet av kyckling embryot. Detta ger ett

Abstract

Kycklingen embryot är en klassisk djurmodell för att studera normala embryots och fostrets utveckling och för xenotransplantation experiment för att studera beteendet hos celler i ett standardiserat

Protocol

1. Isolering och odling av mänskliga stamceller och förberedelse för injektion i embryon

1. Mänskliga stamceller som används som exempel i detta protokoll (hjärna, fett, benmärg) är isolerade på olika sätt från olika vävnader. Till exempel är vuxna neurala stamceller isolerade från vävnader stycken hämtas från ventrikulära väggen i hjärnan under endoskopisk neurokirurgi, som sedan separeras till enskilda celler som odlas in vitro. Den neurala stamceller bildar spontant neurospheres som svävar i odlingsmediet medan andra celltyper hålla sig till botten av skålen ^7. Fett som härrör mesenkymala stamceller hämtas från fettsugning material som enzymatiskt rötas och ansträngt att ta bort fibrös vävnad och sedan centrifugeras för att ta bort mogna adipocyter. Den resulterande cellerna är suspenderade i odlingsmedium kompletteras med serum för att främja spridningen av stamceller än andra celltyper ⁸ hematopoetisk stamcellstransplantation och progenitorceller kan isoleras från aspirat benmärg av positiva val med specifika antikroppar konjugerade med magnetiska partiklar (Myltenyi Biotec, Tyskland eller Dynal-Invitrogen, USA) och magnetisk cellseparation, och / eller använder antikroppar konjugerade till fluoroforer och fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) ^9.
2. För att underlätta senare identifiering, märka stamceller med en fluorescerande markör före implantering i kyckling embryon. Stamceller kan vara märkta med fluorescerande lipofila färgämnen som DII (Invitrogen, USA) eller PKH26 (Sigma, USA) med leverantör-rekommenderade protokoll fram till strax före implantation eller, för en permanent etikett med i huvudsak ingen risk för spridning till värdceller, de kan transduced med genen för ett fluorescerande proteinet som grönt fluorescerande proteinet, med hjälp av Lentiviral vektorer, medan fortfarande i kultur ^10.
3. Protokoll för kultur och spridning av mänskliga stamceller varierar. Detaljerade protokoll finns i litteraturen. Kortfattat är sfär-bildande stamceller vanligtvis odlas i behållare, medan anhängare stamceller är oftast odlas i petriskålar (som underlättar trituration vid delning, se nedan), i lämpligt medium. För delning eller skörd, pellets sfär-bildande celler genom 5 min centrifugering vid 1200rpm och återsuspendera i förvärmda trypsin / EDTA-lösning för mer än 5 min på 37 grader Celsius. För anhängare celler lägga till trypsin / EDTA lösning på petriskål, och kör det i slutet av 5 minuter. Avsluta trypsinization genom att lägga till Ca ^{2 +-innehållande} medium, ibland kompletterat med albumin. För att ta bort trypsin / EDTA, centrifugera celler (5 min på 1200rpm), avlägsna supernatanten, återsuspendera i kallt injektion fordon (oftast medium eller fosfatbuffrad koksaltlösning), och centrifugera igen (5 min vid 1200rpm). Ta bort det mesta av detta supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna att skapa en mycket koncentrerad cellsuspension.
4. Håll suspension av mänskliga stamceller i en liten, tak injektionsflaska eller mikrofugrör på is i upp till flera timmar före injektion. Överlevnad i detta tillstånd kan vara celltyp-beroende. Injektionen fordon måste optimeras beroende på egenskaper hos cellerna, inklusive deras vidhäftningsförmåga (t ex en låg ^{Ca2 +} fordon kan bidra till att förhindra klumpar) och motståndskraft mot hypoxi och pH-förändringar.

2. Ägg inkubation och förberedelse

1. Förvara befruktade ägg i en svalkande kammare (till exempel: Termaks, Bergen, Norge) vid 14-15 ° C före inkubation. Vid denna temperatur utveckling avstannar tills inkubation börjar. Befruktade ägg som lagrats mer än ca 10 dagar eller vid lägre temperaturer har en lägre framtida utveckling och överlevnad.
2. Att blåsa liv i utveckling, placera äggen i en fuktig påtvingad, utkast inkubator (till exempel: Binder, New York, USA) vid 38-39 ° C, och inkubera tills önskad utvecklingsnivå har uppnåtts (för mellanstationer, se ref 11. ).
3. Innan du öppnar ägget, skapa en luftficka ovanför embryo genom att sätta in en 18 nål gauge spruta genom äggskalet (inte för djupt för att undvika att sticka hål på gulan) och evakuera 4 ml av albumin (Figur A). Detta skapar ett tryckfall som inom några minuter är utjämnad med posten av luft genom porösa skal. När luften kommer in som samlas in vid den högsta punkten i skalet, vilket skiljer embryot från insidan av skalet.
4. Täta hål som skapas av sprutans nål med konventionella plasttejp.

3. Dra glas mikropipetter

1. Dra glas mikropipetter av borsilikatglas (till exempel 1,2 OD x 0,94 mm innerdiameter, Harvard Apparatus, USA) på en konventionell elektrod avdragare (t.ex. modell P-2000, Sutter Instruments, USA). Justera avdragare inställningar för att få mikropipetter som har hög Ingångsresistans när den används som microelectrodes. Tips bör vara ca 1-1,5 cm lång. Axlarna kan markeras med 1 mm mellanrum för att beräkna utkastade volymer.
2. Bryt mikropipett tips för en fungerande storlek genom att böja dem med en pincett eller skjuta dem mot en fast yta medan du tittar i mikroskop. Pausen ska vara så jämn som möjligt i ytterkanten av glaset och den resulterande inre diameter på spetsen bör rymmas storleken på celler som skall användas utan att bli igensatta. Vanligtvis en 20-30 mikron innerdiameter fungerar bra.

4. Beredning av Snabb Grön färglösningen (kontrasterande reagens)

1. Bered en 0,1% (w / v) lösning av Fast grönt färgämne (Sigma-Aldrich, USA) genom att lösa upp i kyckling fysiologisk koksaltlösning (137 mM NaCl, 5 mm KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mm MgCl _2, 1 mm Na- fosfat, 5 mm HEPES, 11 mm glukos, pH 7,4).
2. Filtrera Fast Gröna lösningen genom ett 0,22 ìm Millex GP filter (Millipore Co, Bedford, USA).

5. Öppna ägg och kontrasterande embryot

1. Placera två bitar av tejp på toppen av ägget, som omfattar mått luftfickan. Att hålla ägget orienterade så att tejpade området (och därmed luftfickan) är uppåt, skär ett litet fönster inom gränserna för det tejpade området med hjälp av en kraftig dissektion sax. Bandet ger stöd och hjälper till att förhindra äggskal fragment från att falla på embryot. Luftbubblor i samband med luftfickan kan dök med den bakre änden av en plast pipettspets eller annat trubbigt sond.
2. Dra några snabba Grön lösning i en 1 ml spruta med en 25 gauge nål. Ta bort eventuella luftbubblor i sprutan och nålen. Böj nål för att en 45-graders vinkel, tränga in vid en punkt utanför embryonala tallriken (identifieras genom ringen av blodkärl som avgränsar det, piercing i embryonala tallriken ökar dödligheten) och försiktigt vägleda needlepoint under embryot. Injicera färgen tills önskad kontrast uppnås. Embryot, som normalt är öppen, bör nu stå ut som en vitaktig spöke mot den mörka gröna färgen (Figur B). Många utredare använder tusch (utspädd till 10% v / v) i stället för Snabb Green. I detta fall är det viktigt att använda tusch som är giftfri, såsom Pelikan källa tusch.

6. Göra hindbrain och ryggmärgen neurala skador tube

1. Producera slipas volfram nålar med låga-etsning kort (2-3 cm) bitar av 100 ìm diameter volfram stav (katalognummer 719 tusen, A & R Systems, Seattle, Washington), med en acetylen / oxygen ficklampa. Detta görs genom att föra in änden av stången mycket kortfattat i facklan låga tills en gnista syns, som representerar den explosiva erosion av de yttre lagren av volfram och lämnar efter sig en vass spets.
2. Med hjälp av en vass volfram nål, skär igenom och avleda vitelline membranet som täcker området för mikrokirurgi.
3. Hjälp av en andra slipade volfram nål (spetsen av den första nålen är ofta skadad efter skivning genom vitelline membranet och inte passar för senare mikrokirurgi), skär försiktigt genom epitelet överliggande neuralröret och avleda den, sedan skär runt och under pjäsen av neuralröret som ska tas bort, med hjälp av korta, snabba uppåtgående rörelser (Figur C). Göra de tvärgående snitt först och sedan den längsgående snitt är oftast mest framgångsrika. Klipp inte för djupt eller om du riskerar tränga underliggande blodkärl, som normalt är dödlig.
4. Försiktigt flip eller dra avlägsnade vävnaden bit bort från lesionen webbplats med hjälp av volfram nål. Om detta visar sig svårt, det kan också tas bort genom munnen sug hjälp av ett glas mikropipett bifogas slangar.

7. Injektion av mänskliga stamceller

A. Injektion i en lesion av neuralrörsdefekter

Rita en liten mängd celler i spetsen av ett glas mikropipett genom munnen sug hjälp av en plastslang. Arbetsgruppen Koncentrationen av cellsuspensionen måste optimeras för den celltyp som ska injiceras. Montera mikropipett på en mikromanipulator och koppla den till en microinjector pump (till exempel: PV830 Pneumatisk PicoPump, WPI, Washington, USA). Enligt visuell kontroll med hjälp av en dissektion mikroskop, styra mikropipett spets in i lesionen och försiktigt utvisa cellerna genom att öka lufttrycket (antingen genom pulser av konstant tryck eller genom att gradvis ramp upp trycket) (Figur C). När önskad mängd celler deponeras i lesionen webbplatsen, försiktigt dra tillbaka mikropipetten.

b. Injektion i lumen i neuralröret

I vissa fall kan det vara önskvärt att injicera celler i den växande hjärnan ventriklar, till exempel om cellerna är invasiva nog för att få tillgång till nervvävnad i frånvaro av skador. Injektion av celler in i lumen av något brAin regionen kräver att du använder ett utvecklingsstadium där lumen ger en tillräckligt stor behållare och är lättillgängliga, HH steg från 12 till 18 är positiva i detta avseende. En lesion är inte nödvändigt. Bara hål i väggen i neuralrörsdefekter med glaset mikropipett före injektion av celler. De viktigaste delarna för att lyckas med denna metod är skärpan i mikropipett och plötsliga penetrationen, en alltför långsam rörelse och mikropipett spetsen får endast grop neuralröret väggen utan att tränga in.

C. Systemisk injektion

Systemisk injektioner kan göras via den extra embryonala blodkärl (från HH stadium 15, när dessa fartyg är väl utvecklade). Detta är inte ovanligt åtföljs av några blödningar och eftersom det finns många små artärer och färre större vener, intraarteriell injektion är i allmänhet säkrare när det gäller att embryots överlevnad. Å andra sidan, intravenösa injektioner ger snabbare åtkomst av cellerna till hjärtat och därmed troligtvis en jämnare fördelning av cellerna. En lyckad injektion kräver en skarp mikropipett med en diameter mindre än den riktade fartyget. Tillvägagångssätt fartyget längs dess axel på en liten vinkel från horisontalplanet (ca 30 grader). Tryck mikropipett mot fartyget tills fartyget börjar täppa. Tryck sedan vidare i ett företag, abrupta rörelser att penetrera. Dra långsamt tills blodet ses att dra av kapillärverkan in i toppen av mikropipetten. Injektion av celler bör då göras med konstant tryck, varefter mikropipett är tillbaka med en snabb rörelse.

8. Tätning ägget

1. Efter injektionen, låt ägget stå stilla i några minuter så att den injicerade cellerna att bosätta sig och följa. För att undvika uttorkning (som kan inträffa snabbt och kan vara fatal) låg en bit fuktat vävnad eller filterpapper över fönstret under denna viloperiod.
2. Efter några minuter och cellerna har avgjorts, torra skalet runt fönstret och täta fönstret med konventionella plasttejp. Se till att denna tätning är tät och att inga albumin kan läcka genom öppningen eller mellan skalet och bandet (här ofta visar dödliga under efterföljande inkubation).
3. Byt ägg till forcerad utkastet inkubator för vidare utveckling. Iakttagelse kan göras i intervall genom att ta bort tejpen över fönstret.

9. Embryo dissektion

1. När embryot har nått den önskade scenen, spricka öppna ägget i en skål med iskallt fysiologisk koksaltlösning eller fosfatbuffrad saltlösning (tejpen som täcker fönstret ska skäras först att de två halvorna av äggskal att separera). Den iskalla saltlösning används för att söva embryot av hypotermi. Hjärtat bör snabbt bromsa och stanna inom ett par minuter.
2. Separera embryot från extraembryonic membran och steg den med ref. 11.
3. Halshugga embryot, överför den till en dissektion maträtt som har ett golv silikongummi och innehåller syresatt fysiologisk koksaltlösning kompletteras med glukos (137 mM NaCl, 5 mm KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mm MgCl _2, 1 mm Na-fosfat, 5 mM HEPES, 11 mm glukos, pH 7,4) och PIN det snabbt ventrala sidan upp. Ta bort buk och bröstkorg inälvor. Använda en vinklad sax, göra längsgående snitt längs varje ventrolaterala del av ryggraden. Särskilt i senare skeden (efter dag 6 av utveckling), är den första snittet bästa som gjorts i lumbosakrala region där utrymmet mellan kotorna och ryggmärgen är som störst. Ta bort den ventrala delen av ryggraden för att avslöja ryggmärgen. Se till att fysiologisk koksaltlösning förblir syresatt med bubblande till cirka 10-minuters intervaller med ren medicinsk syrgas.
4. Skär försiktigt den begynnande rygg-och ventral rötter på båda sidor, transekt ryggmärgen på önskad nivå, och lyft försiktigt ut av ryggradskanalen. Ryggmärgen kommer att överleva i flera timmar i detta tillstånd och kan utsättas för anatomiska ¹² och fysiologiska ^13,14 experiment.

Figur 1. A) Ett lämpligt tillvägagångssätt för evakuering av albumin. Notera placeringen av embryot och placeringen av nålen. B) Jämföra av embryot. Notera inträngande punkt av nålen utanför embryonala skivan. C) Schematisk bild av förfarandet för ensidig spinal neuralrörsdefekter lesion följt av celltransplantation.

Discussion

Kycklingen embryot är en praktisk och mångsidig djurmodell för xenotransplantation experiment. Avsaknaden av ett fungerande immunförsvar under embryots och fostrets utveckling möjliggör överlevnad och utveckling av celler från en art som tolererar inkuberingstemperaturen. Kyckling embryon har använts för att testa regenerativ potential för olika typer av stamceller (över i ref. 15). Däggdjursceller stamceller kan integrera i vävnaderna kyckling embryo inklusive det centrala nervsystemet, där de kan ge upphov till nervceller vars axonal prognoser kan synaptiska uppkoppling och elektrofysiologiska egenskaper bedömas mot bakgrund av funktionella nervbanor ^1,2.

Eftersom kirurgiska ingrepp är relativt lätt, och injektioner sker under visuella istället för stereotaxic kontroll, kan antalet embryon lätt ökas för att tillgodose olika experimentella förhållanden i ett enda experiment. Normalt celler kan injiceras i 20-30 embryon inom en 4-timmars experimentet. Efter injektionen dödlighet av embryon är den huvudsakliga begränsande faktorn. Åtgärder skall vidtas för att undvika blödning och uttorkning. Var medveten om att det finns vissa kritiska utvecklingsstadier där den naturliga dödligheten ökar. Komplettering embryot med några ml varmt steriliseras, kyckling ringer efter injektionen och dagen innan kritiska utvecklingsstadier, liksom att se till att fönstret i ägget är väl tillslutna och orienterade för att undvika läckage, förbättrar överlevnaden. Om läckage genom tejpen tätningen skulle uppstå, ta bort tejpen, torka ytor och åter tejp. Vissa utredare använda vax och glas eller plast täckglasen att täta fönster. Dödligheten bör inte vara avsevärt annorlunda i sprutas mot simulerad drivna embryon.

Även om vi har fokuserat här på injektion av mänskliga stamceller i Anlage av hjärnan och ryggmärgen, kan stamceller också injiceras i Anlage av andra organ (se till exempel ref. 4). Varje organ ställer sina egna utmaningar. Till exempel kan injicering i hjärtat vara utmanande på grund av hög mekanisk motståndskraft mot pipett penetration och på grund av rörelser, som å andra sidan kan bromsas genom att kyla embryon till rumstemperatur före injektion. Organ som saknar en lumen får inte rymma injektion av tillräckliga volymer och kan därför kräva kirurgisk lesion för att skapa ett kärl. Enligt vår erfarenhet är post-lesion vävnadsregenerering en fördel eftersom det främjar integrationen av mänskliga stamceller i vävnaden. Celler kan också injiceras i embryonala mesenkym såsom spridning somitic mesenkym eller den vandrande neurallist som ett sätt att uppnå införlivande med mesenkymala derivat, inklusive neural crest-derived perifera ganglier ^16,17.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation