Summary
本論文では、培養中の生細胞の機械的刺激のための統合された原子間力光学イメージング顕微鏡の操作で、リーダーに指示することを目指しています。ステップバイステップのプロトコルが表示されます。機械的な刺激に生細胞の応答を示す代表的なデータセットが表示されます。
Abstract
高い空間分解能と時間分解能を持つサブ細胞レベルでの細胞の挙動を調査することができる新技術、生きている細胞は機械的な力を感知するメカニズムを理解するために、およびそれらがどのように対応し、その環境に適応することは開発されました。このように、原子間力顕微鏡（AFM）は、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡と高速回転ディスク（FSD）共焦点顕微鏡と統合されました。統合されたシステムは、リアルタイムでの機械的刺激への細胞応答の直接光イメージングを可能にする、任意の付着生細胞における分子動力学研究の広い範囲にわたって広く適用可能である。アクチンフィラメントと接着斑の大幅な再編成が原因で、細胞体全体の細胞構造に変化を誘導することが頂端細胞の表面での局所力学刺激することが示された。これらの革新的な技術は、機械的な力に反応して生細胞の再構築とダイナミクスを理解するための新たな情報を提供します。機械的な刺激にショーの生細胞応答が記載されている詳細なプロトコールと代表的なデータセット。
Protocol
1。統合顕微鏡システムの概要
これらの研究に使用される顕微鏡システムは、詳細1に記載されている。簡単に言えば、TIRFアタッチメント（オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア州）と反転オリンパスIX - 81顕微鏡は、CSU - 22横河スキャニングヘッド（横河電機株式会社、日本）と組み合わされる。ビオスコープSZ原子間力顕微鏡（Veeco社インスツルメンツ社、サンタバーバラ、カリフォルニア州）は、光学倒立顕微鏡の上部に取り付けられており、全体のシステムは研究用光学テーブルの上（ニューポート、アーバイン、カリフォルニア州）に配置されます。
回転ディスクスキャナー、外付けのフィルターホイールとそのEMCCDカメラ（ローパーサイエンティフィック- Photometrics、ツーソン、アリゾナ州）から構成される共焦点アセンブリは厳密に振動減衰のために必要なシリコンパッド上に配置アルミベースプレートと接続されています。共焦点スキャナは、回転ディスクスキャナからの振動がAFMの測定に影響を与えるしませんようにAFM測定、中に顕微鏡から切り離すことができる踏み襟付きのフランジを介して顕微鏡に接続します。アルゴンクリプトンレーザー（スペクトラフィジックス、マウンテンビュー、カリフォルニア州）はそれぞれ、全反射と共焦点イメージングの両方のモードの励起源として使用され、全反射の添付ファイルまたは走査ヘッドにレーザーを提供する2本の光ファイバで交互に結合することができます。 。 2台のコンピュータがシステムを制御します。Slidebookソフトウェアは、光学イメージングを制御し、ナノスコープのソフトウェアは、AFMを制御します。
2。細胞の文化
特定のタンパク質を標的とGFPコンストラクトを発現している生きている細胞は、24時間前に機械的刺激実験にグラスボトム細胞の培養皿に配置する必要があります。実験日にフェノールレッドを含まない培地で細胞培養の培地を交換してください。細胞培養ディッシュは、磁気襟とAFMステージに搭載されている。
3。 AFMチップの調製と顕微鏡のセットアップ
2ミクロンでカスタマイズAFMチップは、ガラスビーズをDPBSで5回洗浄し、アビジン（1 mg / ml）を、5分間インキュベートし、DPBS 5回で再び洗浄し、1 mg / mLのbiotinilatedで5分間インキュベートされますbiotinilatedフィブロネクチン。先端には、エンド2でさらに5回洗浄し、AFMスキャナ上にマウントし、保護シリコンスカートは、ホルダーの周囲に配置されますされます。視野の中心にAFMの先端を揃えるために、ビデオ視聴のための顕微鏡を設定します。カンチレバーの一番最後にレーザービームを配置することにより、光てこを合わせ、単一細胞イメージングのための適切な高倍率にする目標を変更してください。先端のばね定数は、実験開始前に決定する必要があります。このパラメータは、ナノスコープのソフトウェアで利用可能な熱調整法を用いて測定されます。蛍光イメージングを可能にするためにビデオカメラからEMCCDカメラに切り替えます。その後、セルを選択し、その特定の細胞と接触AFMの先端をもたらす。 20分が細胞表面との接触AFMの時点で形成するために強力な接着斑のために必要な時間を、待機した後、機械的な刺激の手続きが開始されます。
4。ライブセルの機械的刺激
3月4日全反射イメージングは、接着斑の可視化と定量化のための選択の方法となり、回転ディスク共焦点イメージング5は、細胞体全体にアクチン細胞骨格を可視化するために使用されます。 AFM 6は流体下での接触モードのイメージングに使用されます。
セルの全反射や共焦点画像は、機械的な刺激の手順を開始する前に取得されます。機械的な刺激は、一定期間（1〜1.5時間）以上のすべての3〜5分離散的なステップで上方に移動される官能化されたAFMのプローブによって誘導されます。細胞の反応性応答は1秒の単位時間を表す画像の各ライン、高さのイメージとして、ナノスコープのソフトウェアで連続して記録されます。 AFMデータの取得中、オペレータは、常時AFMチップのZ位置は、次のプルダウンのための適切なタイミングを決定するために監視します。
各機械的な刺激の後にそれが継続的にAFMのデータを取得しながら、Slidebookソフトウェアにおけるセルの全反射や共焦点画像を取得することが可能です。光学画像は、アクチン細胞骨格と接着斑の再編成を示してムービーを作成するためにオフラインで処理することができます。また、各画像は、セル面積、特定のタンパク質の領域を決定する、と一般的な細胞形態を分析するために定量的に処理することができます。
実験の終わりにAFMの先端が細胞から回収され、AFMチップの感度は、ナノスコープのソフトウェアで測定されます。
実験は、非常にノイズに敏感です！ EX中に触れてどんな話したり、顕微鏡perimentは避けてください。 AFM測定でノイズを最小限に抑えるために、回転するディスク共焦点は、顕微鏡からデ結合してください。細胞表面と探針の間に強力な接着斑を形成するために待っている時間は、使用する細胞の種類、チップ上の行列のコーティングによって異なる場合があります。
5。代表的な結果
図1。アクチン- MRFPとビンキュリン- GFPをトランスフェ同じ血管平滑筋細胞（VSMC）は次式で画像化した。頂端細胞表面での（A）AFM、（B）基底細胞の表面で全反射、および（C）回転ディスク共焦点顕微鏡細胞体全体に。共焦点画像は3 - Dスタックの最大投影として示されています。 AFMとTIRFや回転するディスク共焦点画像間の良好なオーバーラップは（D）及び（E）、それぞれに示されています。画像サイズは64 × 50ミクロンです。
図2。アクチン- MRFPでトランスフェクトしたVSMCは、機械的にAFMによって刺激され、回転するディスク共焦点顕微鏡で画像化した矢印はそのアクチン繊維を示す：（a）は厚く/重合、（b）の解重合/消える、または（c）により、一緒に結束アクチンの再構築へ。白い点線は、セルの上にAFMチップを表します。画像サイズポスター91 x 91ミクロン。
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Discussion
細胞骨格7-10と接着斑11-16細胞が移動または機械的な力17に対応するように、組み立て分散とめくる動的な構造です。彼らは、細胞増殖、生存、および遺伝子発現の調節において重要な機能を持っています。彼らの特定の分布と動態を知ることは、細胞がマトリックスで、自分自身との間の通信方法のより良い理解を提供します。
この新しい顕微鏡システムは、任意の付着生細胞における分子動力学研究の広い範囲にわたって広く適用可能である。統合された顕微鏡は、急速なサブ細胞の変化の定量的なモニタリングを可能にし、機械的な力に反応して細胞のリモデリングの基本的なプロセスを理解する上で重要な新たなツールを提供しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
ビンキュリン- GFPプラスミドは、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所のケネス山田、国立衛生研究所から贈られた、プラスミドベセスダ、メリーランド州、およびアクチン- MRFPはマイケルソン、フロリダ州立大学、タラハシー、フロリダ州から寄贈されたもの。
この作品は、Andreea TracheにNSFのキャリア賞＃0747334とAHA -ナショナルSDG＃0835205Nによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
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