Summary
Целью данного документа является указание читателя в работе интегрированной атомно-силовой микроскоп-оптических изображений для механической стимуляции живых клеток в культуре. Шаг за шагом протокол представлен. Набор репрезентативных данных показывает жить клеточного ответа на механическое раздражение представлена.
Abstract
Чтобы понять механизм, посредством которого живые клетки смысле механических сил, и как они реагируют и приспосабливаются к окружающей среде, новые технологии способны исследовать клетки поведения на субклеточном уровне с высоким пространственным и временным разрешением был разработан. Таким образом, атомно-силового микроскопа (АСМ) была интегрирована с полным внутренним отражением флуоресценции (TIRF) микроскопии и быстро вращающийся диск (ФУР) конфокальной микроскопии. Интегрированная система широко применяется в широком диапазоне молекулярных динамических исследований в любой сторонник живых клеток, что позволяет прямых оптических изображений клеточного ответа на механическое раздражение в режиме реального времени. Значительные перестройки актиновых филаментов и координационные спайки было показано из-за местных механических раздражений на апикальной поверхности клеток, что индуцированные изменения в клеточной структуре всей клетке тела. Эти инновационные технологии, будет предоставлять новую информацию для понимания живых клеток и реструктуризации динамика в ответ на механическую силу. Подробный протокол, а также представитель набор данных, которые показывают, жить клеточного ответа на механическое раздражение представлены.
Protocol
1. Обзор интегрированной системы микроскоп
Микроскопа, который используется для этих исследований подробно описаны в 1. Короче говоря, перевернутую Olympus IX-81 микроскоп с TIRF привязанности (Олимп, центр долины, PA) в сочетании с CSU-22 Yokogawa сканирующей головки (Yokogawa Electric Inc, Япония). Bioscope SZ атомно-силового микроскопа (Veeco Instruments Inc, Санта-Барбара, Калифорния) устанавливается на верхней части оптического инвертированного микроскопа, и вся система помещена в верхней части исследования оптических класса таблицы (Ньюпорт, Irvine, CA).
Конфокальной ассамблеей, состоящей из вращающегося диска сканер, внешний фильтр колесо и его EMCCD камеры (Roper Научно-Фотометрические, Tucson, AZ), жестко соединены с алюминиевой пластине базы размещены на площадке кремния необходимы для гашения вибраций. Конфокальный сканер соединяется с микроскопом через фланец с резьбовым воротник, который можно отделить от микроскопа в процессе измерений AFM, например, что никакой вибрации от сканера прядильно-диск повлияет на АСМ-измерений. Аргон-Криптон лазер (Spectra Physics, Mountain View, Калифорния) используется в качестве источника возбуждения для обеих TIRF и конфокальной режимах съемки, и может быть связана попеременно в двух оптических волокон, которые доставки лазерного привязанности TIRF или сканирующей головки, соответственно . Два компьютера управления системой: Slidebook программное обеспечение контроля оптических изображений и Наноскоп программного обеспечения управления АСМ.
2. Культуре клеток
Живая клеток, экспрессирующих GFP конструкций направлены против специфических белков должны быть помещены в камеру стеклянную посуду культуры дно за 24 часа до механический эксперимент стимуляции. В день эксперимента заменить среду клеточной культуры с фенолом красным среде без. Блюдо культуре клеток устанавливается на стадии АСМ с магнитным воротник.
3. АСМ Подготовка и микроскоп Настройка
Иглой АСМ настроены с 2 микрона biotinilated стеклянная бусина будет пять раз промывают DPBS и затем инкубируют 5 мин с авидин (1 мг / мл), промывают снова DPBS в пять раз, а затем инкубируют 5 мин с 1 мг / мл biotinilated фибронектина. Наконечник будут смыты еще пять раз в конце 2, установленный на сканере АСМ, а затем защитной юбке кремния будут размещены вокруг держателя. Установите микроскоп для просмотра видео, чтобы выровнять иглой АСМ в центре поля зрения. Выравнивание оптического рычага путем размещения лазерного луча в самом конце кантилевера, а затем изменить цель высокая цель увеличения надлежащее для одного изображения клетки. Весной константа наконечник должен быть определен до начала эксперимента. Этот параметр будет измерена с помощью термического метода настройки доступны в Наноскоп программного обеспечения. Переход с видеокамерой, чтобы EMCCD камеры, чтобы обеспечить расцвет изображений. Затем выберите ячейку и принести иглой АСМ в контакт с этой конкретной клетки. После 20 минут ожидания времени, которое необходимо для сильного координационного адгезией к форме в точке АСМ контакт с клеточной поверхности, механическая процедура стимуляции начнется.
4. Механическое раздражение живой клетки
TIRF изображений 3-4 будет методом выбора для визуализации и количественной координационного спайки, и прядильно-диск конфокальной микроскопии 5 будет использоваться для визуализации актина цитоскелета по всей клетке тела. АСМ-6 будет использоваться в контакте режим съемки под жидкости.
TIRF и конфокальной образ ячейки будут приобретаться, прежде чем начать процедуру механической стимуляции. Механическая стимуляция быть вызвано функциональными зонда АСМ, которые будут перемещены вверх в дискретных шагов каждые 3-5 минут в течение определенного периода времени (1-1,5 часа). Клетка реактивной ответ будет записано последовательно и в Наноскоп программного обеспечения в виде серии высота изображения, каждая строка в изображение, представляющее единицу времени 1 сек. Хотя приобретение АСМ данных, мониторы оператора в любой момент времени г-положение иглой АСМ для определения правильного времени следующего тянуть.
После каждой механической стимуляции можно приобрести или конфокальной TIRF образ ячейки в Slidebook программного обеспечения, в то время непрерывно приобретения АСМ данных. Оптические изображения можно обрабатывать автономно для создания фильмов, которые показывают, цитоскелета актина и координационные реорганизации спаек. Кроме того, каждое изображение можно обработать количественно определить область ячеек, удельная площадь белка, и анализ общей морфологии клетки.
В конце эксперимента иглой АСМ выводится из клетки и АСМ чувствительность будет измеряться в Наноскоп программного обеспечения.
Эксперимент очень чувствительных к шуму! Любой разговор или микроскоп во время трогательной бывшихЭксперимент следует избегать. Чтобы свести к минимуму шум в АСМ измерений, вращающийся диск конфокальной должно быть отделено от микроскопа. Время ожидания для формирования сильного координационного адгезии между поверхностью клеток и иглой АСМ может варьироваться в зависимости от типа клеток используется и матрица покрытием на конце.
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. То же сосудистых гладких мышечных клеток (VSMC) трансфицированных актин-mRFP и винкулин-GFP было изображено: () АФМ на апикальной поверхности клетки; (B) TIRF на базальной поверхности клетки, и (C) вращающийся диск конфокальной микроскопии по всей клетке тела. конфокальной изображение отображается в виде максимальной проекции 3-D стека. Хорошо совпадений между АСМ и TIRF или вращающийся диск конфокальных изображений показаны на (D) и (Е) соответственно. Размер изображения составляет 64 х 50 микрон.
Рисунок 2. VSMC трансфицированных актин-mRFP был механически стимулированных АСМ и изображено прядильно-диск конфокальной микроскопии стрелки указывают актиновых волокон, которые:. () Полимеризуются / утолщаются, (б) деполимеризоваться / исчезают, или (в) расслоение вместе из-за с актином реструктуризации. Белый пунктирные иглой АСМ над ячейкой. Размер изображения 91 х 91 микрон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
7-10 цитоскелета и фокальных спайки 11-16 динамические структуры, которые собираются, разойтись и перевернуться, как клетки мигрируют или ответить на механическую силу 17. Они имеют важные функции в регуляции клеточного роста, выживания и экспрессии генов. Зная их специфическое распределение и динамика обеспечивает лучшее понимание того, как клетки общаются с матрицей и между собой.
Эта новая система микроскопа широко применима в широком диапазоне молекулярных динамических исследований в любой сторонник живых клеток. Интегрированные микроскоп позволяет количественный мониторинг быстрого субклеточных изменений и является важным инструментом для понимания романа основной процесс клеточной реконструкции в ответ на механическую силу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Винкулин-GFP плазмида подарок от Кеннета Ямада, Национальные институты здравоохранения, Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований, Bethesda, штат Мэриленд, и актин-mRFP плазмиду подарок от Майкла Дэвидсона, Университет штата Флорида, Таллахасси, штат Флорида.
Эта работа была поддержана NSF Карьера награду # 0747334 и AHA-Национальный SDG # 0835205N к Андреа трахеи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
