Summary
Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.
Abstract
Canlı hücreler mekanik kuvvetlerin anlamda mekanizmasını anlamak ve alt hücresel düzeyde yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin davranışını araştırmak için tepki ve çevreleriyle uyum nasıl yeni bir teknoloji geliştirildi. Böylece, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM), toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi ve hızlı dönen disk (FSD) konfokal mikroskobu ile entegre edildi. Entegre bir sistem, gerçek zamanlı mekanik uyarılması hücre yanıtları doğrudan optik görüntüleme sağlayan geniş yapışık herhangi bir canlı hücreler moleküler dinamik çalışmaların geniş bir aralığında uygulanabilir. Aktin filamentler ve odak yapışıklıklar önemli düzenlenmesi nedeniyle apikal hücre yüzeyinde hücre gövdesi boyunca hücresel yapıya değişikliklerin neden olduğu yerel mekanik stimülasyonu gösterildi. Bu yenilikçi teknikler, mekanik güç, cevap canlı hücre yeniden yapılanma ve dinamikleri anlamak için yeni bilgiler sağlayacaktır. Ayrıntılı bir protokol ve temsil eden bir veri mekanik stimülasyonu göstermek için canlı hücre yanıtı verildikleri ayarlayın.
Protocol
1. Entegre Mikroskop Sistemi Genel Bakış
Bu çalışmalar için kullanılan mikroskop sistemi 1 ayrıntılı tarif edilmiştir. Kısaca, TIRF eki (Olympus, Center Valley, PA) ile ters bir Olympus IX-81 mikroskop ile birlikte CSU-22 Yokogawa tarama kafası (Yokogawa Elektrik A.Ş., Japonya). Bioscope SZ atomik kuvvet mikroskobu (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA), optik ters mikroskop üstüne monte edilir ve tüm sistemi bir araştırma notu optik tablonun üst (Newport, Irvine, CA) üzerine yerleştirilir.
Konfokal montaj dönen disk tarayıcı, dış filtre çarkı ve EMCCD kamera (Roper Bilimsel Photometrics, Tucson, AZ) oluşan katı titreşim sönümleme için gerekli bir silikon pad üzerine yerleştirilen alüminyum taban plakası ile bağlantılıdır. Konfokal tarayıcı oluklu bir yaka ile AFM ölçümleri sırasında mikroskop ayrılabilir bir flanş ile mikroskop ile bağlanır dönen disk tarayıcı hiçbir titreşim AFM ölçümleri etkileyecektir. Bir Argon-Kripton lazer (Spectra Fizik, Mountain View, CA), sırasıyla TIRF ve konfokal görüntüleme modları için uyarma kaynağı olarak kullanılır ve alternatif TIRF eki veya tarama kafası lazer sağlayan iki optik fiberler akuple edilebilir . İki bilgisayar sisteminin kontrolü: Slidebook yazılımı optik görüntüleme kontrolleri ve NanoScope yazılım AFM kontrol.
2. Hücre Kültürü
Canlı hücreler, belirli proteinlere karşı hedeflenen GFP yapıları ifade mekanik stimülasyonu deneyi 24 saat önce bir bardak alt hücre kültürü çanak konulmalıdır. Deney günü, fenol red-free orta ile hücre kültür ortamı değiştirin. Hücre kültürü çanak manyetik bir yaka ile AFM sahne üzerine monte edilmiştir.
3. AFM İpucu hazırlanması ve Mikroskop Set-up
2 mikron ile özelleştirilmiş AFM ucu, cam boncuk DPBS beş kez yıkanmış ve daha sonra 5 dakika avidin (1 mg / ml) ile inkübe, DPBS beş kez tekrar yıkanır ve daha sonra 1 mg / ml biotinilated ile 5 dakika inkübe olacak biotinilated fibronektin. Sonunda 2 ucu, beş kez daha yıkanarak AFM tarayıcı üzerine monte edilmiş ve daha sonra koruyucu silikon etek sahibinin etrafında alınacaktır olacak. Görüş alanının merkezinde AFM ucu hizalamak için video görüntüleme için mikroskop ayarlayın. Konsolun en sonunda lazer ışını koyarak optik kolu hizalayın ve sonra tek hücre görüntüleme için uygun bir yüksek büyütme amacı hedefi değiştirmek. Ucu sürekli bahar, deney başlamadan önce belirlenmelidir. Bu parametre NanoScope yazılım mevcuttur termal ayar yöntemi kullanılarak ölçülür. Floresans görüntüleme için izin EMCCD kamera, video kamera geçin. Sonra, bir hücre seçin ve bu belirli bir hücre ile temas AFM ucu getirmek. Hücre yüzeyi ile temas AFM noktada oluşturmak için güçlü bir odak yapışma için gerekli 20 dakika bekleme süresinden sonra, mekanik stimülasyonu prosedürü başlayacak.
4. Canlı Hücre Mekanik Uyarım
3-4 TIRF görüntüleme odak yapışıklıklar görselleştirilmesi ve ölçülmesi için tercih edilen bir yöntem olacak, ve dönen disk konfokal görüntüleme 5 hücre gövdesi boyunca aktin hücre iskeletinin görselleştirmek için kullanılacaktır. AFM 6 sıvı temas modunda görüntüleme kullanılır.
Hücre TIRF veya konfokal görüntü mekanik stimülasyonu işlemine başlamadan önce alınacaktır. (1-1,5 saat) bir süre içinde her 3-5 dakikada bir ayrık adımlarla yukarı doğru hareket olacaktır Fonksiyonlu AFM prob mekanik stimülasyonu ile indüklenen olacaktır. Hücre reaktif-yanıt yüksekliği görüntü, görüntü temsil eden 1 sn bir birim zamanda her satırı bir dizi olarak NanoScope yazılım sürekli olarak kaydedilecektir. AFM veri elde edilirken, operatör sonraki çekme için uygun zamanlama her zaman AFM ucu z-pozisyon belirlemek için izler.
Her mekanik stimülasyonu sonra sürekli AFM veriler elde edilirken, Slidebook yazılımı hücre TIRF veya konfokal görüntü elde etmek mümkündür. Aktin hücre iskeleti ve odak yapışıklıklar yeniden yapılanma gösteren filmler optik görüntü oluşturmak için off-line işlenebilir. Ayrıca, her görüntü hücre alanı, spesifik protein alanı belirlemek ve genel hücre morfolojisi analiz etmek için kantitatif olarak işlenmiş olabilir.
Deneyin sonunda AFM ucu hücre ve AFM ucunun hassasiyeti çekilen NanoScope yazılım ölçülecektir.
Deney çok gürültüye duyarlı! Eski sırasında dokunmadan herhangi bir konuşmaya ya da mikroskopdeneyimlemek önemlidir kaçınılmalıdır. AFM ölçümlerde gürültü en aza indirmek için, dönen disk konfokal mikroskop de çiftli olmalıdır. Hücre yüzeyi ve AFM ucu arasında güçlü bir fokal adezyon oluşturmak için bekleme süresi, kullanılan hücre tipi ve ucunda matris kaplamalı bağlı olarak değişebilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Aktin-MRFP ve vinculin-GFP ile transfekte aynı damar düz kas hücre (VSMC) tarafından görüntülenmiş oldu: (A) apikal hücre yüzeyinde AFM, (B) bazal hücre yüzeyinde TIRF; ve (C) iplik disk konfokal mikroskopi hücre gövdesi boyunca konfokal görüntü 3-D bir yığın maksimum projeksiyon olarak gösterilmiştir . AFM ve TIRF veya dönen disk konfokal görüntüler arasında iyi örtüşür, (D) ve (E), sırasıyla gösterilmiştir . Görüntü boyutu 64 x 50 mikron.
Şekil 2. Bir vasküler düz kas aktin-MRFP ile transfekte mekanik AFM tarafından uyarılan ve iplik disk konfokal mikroskopi tarafından görüntülendi oklar aktin liflerinin gösterir: (a) kalınlaşmasına / Polimerize, (b) depolymerize / kaybolurken, veya (c) nedeniyle bir araya toplamak aktin yeniden yapılanma. Beyaz kesik çizgiler hücrenin üstündeki AFM ucu temsil eder. Görüntü boyutu 91 x 91 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitoiskelet 7-10 ve odak yapışıklıklar 11-16, montajı, dağıtmak ve hücreleri göç veya mekanik güç, 17 cevap olarak teslim dinamik yapılardır . Hücre büyümesi, hayatta kalma ve gen ekspresyonu düzenlenmesinde önemli işlevleri var. Kendi özel dağıtım ve dinamikleri bilmek hücreleri matrisi ve kendi aralarında nasıl iletişim daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Bu yeni mikroskop sistemi yapışık herhangi bir canlı hücreler moleküler dinamik çalışmaların geniş bir yelpazesinde geniş uygulanabilir. Entegre mikroskop, hızlı bir şekilde alt-hücresel değişiklikler kantitatif izlenmesini sağlar ve mekanik güç yanıt temel hücresel remodeling süreci anlamak için önemli bir roman araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Plazmid Vinculin-GFP Michael Davidson, Florida Eyalet Üniversitesi, Tallahassee, Florida'daki bir hediye plazmid Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diş ve Kraniofasial Araştırma Enstitüsü, Bethesda, Maryland ve aktin-MRFP Kenneth Yamada bir hediye oldu.
Bu çalışma, NSF Kariyer Ödülü # 0747334 ve AHA-Milli SDG # 0835205N Andreea Trache tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
