Summary
العوامل الخلية المضيفة تلعب دورا حاسما في إنشاء وصيانة ساركومة كابوزي (كانساس). نحن مخطط طرق لتحديد العوامل الخلية المضيفة تغيير في الخلايا المصابة KSHV DMVEC ، وفي نسيج الورم KS وسوف تغير من الجينات الخلوية الفيروس بمثابة هدف محتمل ل المداواة الرواية.
Abstract
KS حاليا هو الأكثر الغالب فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز خبيثة ذات الصلة في افريقيا الجنوبية ، وبالتالي في العالم ، 1،2 ويتميز بأنه من الخلايا السرطانية angioproliferative بطانة الأوعية الدموية وتنتج الخلايا باء الأمراض النادرة يمفاوية في شكل اللمفومات الانصباب الجنبي (PEL) وبعض أشكال المرض في عديد المراكز Castleman. 3-5 1-5 ٪ فقط من الخلايا في KS الآفات تدعم بنشاط من تكرار lytic كابوزي ساركومة المرتبط هربس (KSHV) ، العامل المسبب للمرض المرتبطة KS ، ومن الواضح أن هناك عوامل يجب الخلوية تتفاعل مع عوامل فيروسية في عملية oncogenesis وتقدم الورم. 6،7 تحديد رواية المضيف عامل المحددات التي تساهم في أمراض KS أمر ضروري لوضع علامات لتطور الورم النذير والانبثاث فضلا عن تطوير علاجات جديدة لعلاج KS 8 تفاصيل الفيديو المصاحبة للأساليب التي نستخدمها لتحديد استضافة برامج التعبير الخلية الجينات في خلايا الجلد تغيير بطانة الاوعية الدموية الدقيقة (DMVEC) بعد الإصابة KSHV في نسيج الورم وKS 9 حالما يتم تحديدها من خلال تحليل الجينات dysregulated ميكروأري ، والتغيرات في تعبير البروتين أكدت طخة مناعية والمزدوجة المناعي المسمى. وأكد تغييرات في التعبير عن الجينات الترانسكربتي dysregulated في المختبر بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (qRT - PCR). كما يتم تنفيذ التحقق من النتائج في المختبر باستخدام المحفوظات نسيج الورم KS المزدوجة التي وصفت وكيمياء مناعية ميكروأرس الأنسجة. 8،10 نهجنا لتحديد الجينات dysregulated في نسيج الورم KS المكروية سيسمح للتنمية في المختبر وبعد ذلك في نموذج الجسم الحي للأنظمة اكتشاف وتقييم علاجية جديدة محتملة لعلاج KS.
Protocol
1. KSVH زراعة والعدوى من DMVEC
- المثقف هو خط الخلية BCBL - 1 ، فصل أصلا من سرطان الغدد الليمفاوية تجويف الجسم البشري مقرها في وسائل الإعلام كاملة RPMI 1640 (Gibco ، وغراند ايلاند ، نيويورك). تتم إزالة الخلايا BCBL - 1 من النيتروجين السائل ، وتنقل على الثلج الجاف ، وسرعان ما تحسنت لمدة 1 دقيقة في 37 درجة مئوية. يضاف قسامة 50 ميكرولتر من الخلايا - 1 BCBL في مناطق ذات كثافة 1x10 4 خلايا / مل و 500 مل من وسائل الإعلام 1640 RPMI تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين ، البنسلين 1X / الستربتوميسين ووزعت في قوارير الطول 175 ، في 50 مل / قارورة .
- ثم يتم تحضين قوارير من الخلايا BCBL - 1 في 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2 حتى وصلت كثافة الخلية 3x106 خلية / مل. وبفعل تكاثر الفيروس Lytic دورة بإضافة TPA في بوتيرات 20ng / مل والصوديوم في 0.3 نانوغرام / مليلتر.
- تغسل أربع وعشرين ساعة آخر التعريفي الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني pH7.4 في حجم 40 مل بواسطة الطرد المركزي عند 1500 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي Sorvall RT الأسطورة (لإزالة بوتيرات) ، والحث المستمر مع TPA في 20 نانوغرام / مل في RPMI 1640 لمدة 5 أيام أخرى.
- يتم عزل الفيروس الخلية الحرة وتتركز بواسطة الطرد المركزي المغاير. لفترة وجيزة ، وخلايا والحطام الخلية الأولى في مكعبات 10000 دورة في الدقيقة في C RC - 6 زائد الطرد المركزي في 4 درجات Sorvall لمدة 30 دقيقة. تتم إزالة طاف احتواء الفيروس ومكعبات فيروس مجانا خلية في نابذة فائقة السرعة بيكمان كولتر L - 90K أوبتيما في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة بمعدل 25000 دورة في الدقيقة.
- إزالة خالية من الفيروسات وطاف بيليه الفيروسية معلق في وسائل الإعلام تجميد (سلفوكسيد ثنائي ميثيل 10 ٪ و 90 ٪ الجنين مصل العجل) وتخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
KSHV العدوى من الخلايا DMVEC الابتدائي. - ومطلي DMVEC الخلايا في مستوى 2-5 في كثافة مرور الأولية من 1 5 10 X في 100x20mm أطباق زراعة الأنسجة أو الشرائح الغرفة ، ويتم الاحتفاظ بها في وسائل الاعلام EMB - 2 كاملة (Lonza ، بازل ، سويسرا) في 37 درجة مئوية في ثاني جو من 5 ٪ 2. التقاء في 80 ٪ ، يصاب DMVEC في وزارة الداخلية من 0.01 ، وتستخدم وهمية المصابة (وسائل الاعلام فقط) الخلايا كما الضوابط. يضاف إلى خلايا جديدة وسائل الاعلام كل يوم 2.
- ويتم فحص الخلايا monolayers DMVEC والشرائح الغرفة يوميا للحصول على أدلة من العدوى كما لاحظ تشكيل خلية المغزل. بعد أول بادرة من تشكيل خلية مغزلية (7-14 أيام) نوقف التغيرات وسائل الإعلام. ومع ذلك ، يمكن أوقات أطول في الحضانة تتجاوز 15-21 يوما من دون تقديم تنازلات جديدة وسائل الاعلام على سلامة الخلايا مما يؤدي إلى DMVEC الخلايا الميتة أو رفع قبالة صحن الثقافة.
- عند نقطة الإنغزال القصوى خلال العدوى ، ويتم حصاد monolayers خلية لإعداد الكريات الخلية لاستخراج البروتين أو الحمض النووي الريبي. تغسل الخلايا المصابة على الشرائح DMVEC الغرفة مرتين مع 1 مل / الإطار مع درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت 7.4. ويتم حصاد الخلايا على الشرائح غرفة الغسيل بعد 2X مع الرقم الهيدروجيني PBS 7.4. سمح لهم حتى يجف تماما قبل إزالة الغرف ووضع الشرائح في الميثانول بنسبة 100 ٪ التي عقدت في -20 درجة مئوية لحين الحاجة لتلطيخ مناعي (IFA).
2. مجموع رنة عزل وإنتاج [كدنا] من موك وKSHV DMVEC المصابة
- يتم استخراج الحمض النووي الريبي من مجموع المصابين KSHV DMVEC والخلايا المصابة وهمية باستخدام RNesay Qiagen البسيطة KIT (Qiagen ، فالنسيا ، CA). يعمل بروتوكول الشركة المصنعة لمعالجة الأنسجة الحيوانية ولكن من دون خطوات التجانس ، إذا الخلايا المستزرعة هي المصدر المستخدم لعزل الحمض النووي الريبي.
- حدد الخيار عرضت لعلاج RNA مع DNAseI على العمود باستخدام الحمض النووي الريبي Qiagen مجانا الدناز كيت ، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة الموجودة في الملحق من دليل التعليمات. DNAaseI يحط أي تلويث أو الجينوم الحمض النووي الفيروسي من إعداد الحمض النووي الريبي. العلاج DNAseI أمر حاسم بالنسبة لتطبيقات تيار باستمرار بما في ذلك RT - PCR ، PCR qRT والتحليلات ميكروأري.
- يغتسل RNA وفقا لتعليمات وأي الإيثانول المتبقية في المخزن المؤقت هو غسل تحذف من قبل الطرد المركزي في عمود واحد وقتا أكثر مما المقترح من قبل المصنع. الإيثانول المتبقية التنازلات نقاء من الحمض النووي الريبي بعد شطف.
- بعد غسل النهائي يتم تنفيذ خطوة إضافية قبل الطرد المركزي يمكن eluted الحمض النووي الريبي من العمود. هو الحمض النووي الريبي eluted من العمود مع 30 ميكرولتر من المياه المجانية ريبونوكلياز. وكميا ثم الحمض النووي الريبي وتحليلها من أجل نقاء على AG - 6131 - إيبندورف فوتومترية بيو. وينبغي أن نسبة الكثافة الضوئية (260/280 نانومتر) يمكن between1.8 - 2.0 ، هو الحال بالنسبة للنقاء عالية من الحمض النووي الريبي.
- للتحليل [ميكروأري ، ويتم تحليل الحمض النووي الريبي على Bioanalyzer 2100 اجيلنت باستخدام خوارزمية البرامج RIN. التحليل على bioanalyzer يتيح لك مع رقم النزاهة الحمض النووي الريبي (رين) من 1-10 ، ومع ذلك فقد أثبتت الأرقام RIN 7-10 تسفر عن نتائج متسقة وموثوق بها أكثر لتحاليل [ميكروأري qRT أو PCR. عدد RIN متوسط إيزولا RNAتيد مع عدة RNAeasy Qiagen في أيدينا نطاقات 7،5-9.
- ويتحقق الكميات من الحمض النووي الريبي بإضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي eluted من عمود إلى 99 ميكرولتر من تريس 10MM - EDTA الرقم الهيدروجيني 7.6. خلط الحمض النووي الريبي والعازلة مع ماصة ، وأضاف إلى كفيت نظيفة للتحليل الطيفي مع فوتومترية - بيو إيبندورف.
- وتستعد رسول الحمض النووي الريبي في أحد ميكروجرام لكل عينة عشوائية باستخدام hexamers المقدمة من قبل الشركة المصنعة ، وذلك قبل النسخ العكسي بسعة [كدنا] السامي عكس عدة نسخ (النظم البيولوجية التطبيقية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا).
[كدنا] توليف - لتجميع واحدة من الحمض النووي الريبي [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل مجموع نستخدم قدرة عالية عكس النسخ [كدنا] مجموعة من النظم البيولوجية التطبيقية والمضي قدما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- يتكون مزيج الرئيسي 2X الكواشف ويضاف 0،5-1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في مجلد من 10 إلى 10 ميكرولتر ميكرولتر من مزيج الرئيسي كاشف 2X. الحل الناتج 1X مختلطة بلطف ويتم تنفيذ النسخ العكسي في cycler BIORAD مصغرة themal MJ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ويمكن استخدام ما يصل الى اثنين ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع بنسبة 20 ميكرولتر رد فعل. هو quantitated [كدنا] في 260 نانومتر في AG - 6131 - فوتومترية إيبندورف بيو ، وتخزينها في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لqRT - PCR.
3. ميكروأري تحليل مقارن للخلايا وهمية وKSHV DMVEC المصابة
مختبرنا يقوم بتحليل [ميكروأري في جامعة فاندربيلت المركز الطبي مرفق المشتركة ميكروأري الموارد الأساسية على أساس تحصيل الرسوم مقابل الخدمات. قارنا الناتج عن التقلبات الملفات الترانسكربتي من الجينات في الخلايا المصابة KSHV DMVEC بالسخرية من الخلايا المصابة السيطرة. يتم التحقق من صحة الجينات في خلايا dysregulated الترانسكربتي KSHV المصابة التي هي ذات الصلة لانتشار الأوعية الدموية الخلية ، أو التي تمثل المؤشرات الحيوية المنتشر في المختبر باستخدام خلايا المصابة KSHV DMVEC الحقيقي باستخدام PCR الوقت ، البقع الغربية ، وايفا المزدوجة ؛ تتم مقارنة النتائج على النتائج في الورم KS الأرشيفية الأنسجة.
4. RT - PCR الكمي تحليل الجينات الترانسكربتي Dysregulated تم العثور عليها في DMVEC موك والمصابين ، KSHV
- يتم تنفيذ الوقت الحقيقي PCR في 96 أيضا لوحات بصرية (سورنسون العلوم البيولوجية ، وشركة) باستخدام الناسخ العكسي ولدت [كدنا] منشؤها من عينة الحمض النووي الريبي تنقية واستخدام واحدة MyiQ اللون الحقيقي الكشف عن نظام PCR الوقت (بيو راد مختبرات ، هرقل ، كاليفورنيا) و 25 مجلدا رد فعل ميكرولتر. ويتم هذا الإجراء في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب تلوث محتمل من قبل DNA دخيلة / [كدنا] التي قد تكون موجودة في الغرفة.
- ويتم إعداد مزيج رئيسي في 1.5 أنابيب مل لكل مجموعة التمهيدي (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) باستخدام SYBR الخضراء Supermix (بيو راد مختبرات ، هرقل ، كاليفورنيا) ، واختارت الأمام والاشعال عكس لكل جينة من الفائدة ، وبتركيز 250 نيوتن متر لكل بئر وردت في الخطوط RNAase DNAase O. 2 H وينبغي أن يتم كل عينة في ثلاث نسخ.
- متواليات التمهيدي لqRT - PCR لجينات الخلية المضيفة لتشمل تسلسل التمهيدي LANA KSHV ، والذي هو كمون الفيروس المرتبطة مستضد النووية التي يتم التعبير بشكل كبير في الخلايا المصابة KSHV DMVEC والأورام KS.
- وتضعف نانوغرام / 10 cDNAs الأسهم المجاهدين من الخلايا المصابة بالعدوى وهمية KSHV DMVEC 01:03 به RNAase DNAase مجانا H 2 O ؛ يضاف 3μL هذا التخفيف إلى كل بئر. التحكم في المياه الآبار بديلا عن [كدنا].
- وأغلقت 96 لوحة جيدا مع الشريط ختم البصري (بيو راد مختبرات) ، مختلطة بلطف وطرد لمدة 2 دقيقة على 1000 دورة في الدقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة ، لجمع خليط التفاعل في قاع الآبار. يتم تشغيل الكشف عن MyiQ بيو راد النظام والمصباح في هذا الوقت للسماح لمدة 10 دقيقة الاحماء قبل بدء التشغيل.
- دخل برنامج تسلسل دورة يوضع ثم طرد 96 لوحة جيدا الى بيو راد M معدل الذكاء واحدة لون النظام في الوقت الحقيقي الكشف PCR ، وحفظها ، وبدأ تشغيل.
- تسلسل الدراجات كما يلي : 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 81 دورات الكلية. يتم تضمين منحنى تذوب في هذا البرنامج باعتباره الاختيار للكفاءة التمهيدي. يتم تضخيمه مجموعة GAPDH التمهيدي ، وتضمن للتطبيع.
- ويتم تحليل البيانات مع بيو راد iQ5 البصرية نظام إصدار البرنامج 2.
5. المزدوج التحليل المناعي للخلايا إعتبر KSHV DMVEC المصابة
- المجففة الهواء تغسل الشرائح الغرفة (إزالتها من الغرف) تحتوي على كل DMVEC متموجة المصابة وغير المصابة مرتين مع الرقم الهيدروجيني 7.4 برنامج تلفزيوني ، والثابتة في -20 ° الميثانول قبل المبردة C المطلق لمدة 10 دقائق وعقدت في -20 درجة مئوية.
- الشرائح مع الخلايا الان الهواء المجففة لمدة 15 دقيقة ، وتوضع في وعاء يحتوي على الجليد Coplin تريس المالحة (0.05M تريس الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 5 دقائق. ثم يتم تحضين الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب بمزيج من الاجسام المضادة لLANA KSHV في تخفيف الحموضة في 1:50 PBS 7.4 (ناقل مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الماعز النسائل المتعددة (1 : 100 في تخفيف الحموضة PBS 7.4) ضد المضيف البروتين جدت لتكون عامل dyregulated ميكروأري بواسطة استخدام خلايا KSHV DMVEC المصابة.
- ثم يتم غسل الخلايا 3X مع المالحة تريس (لم تسمح للخلايا لتجف) وحضنت لمدة 30 دقيقة ثم مع مزيج من الأضداد حمار الثانوية مفتش مكافحة الماوس مترافق مع الأضداد المضادة للماعز رودامين - X الحمراء والحمير لمترافق FITC (جاكسون ImmunoResearch ، غرب غروف ، والسلطة الفلسطينية) ، وكلاهما في التخفيف 1:100 في برنامج تلفزيوني.
- يتم غسلها في وقت لاحق الخلايا 3X المالحة في تريس في جرة Coplin وبينما لا تزال رطبة الشرائح ، هي التي شنت على الشرائح مع تزايد وسائل الاعلام Vectashield (ناقلات مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) تحتوي على 1.5 غرام / مليلتر من دابي وساترة ملف.
- ويلاحظ مضان والصور مع صور المجهر نيكون 2000S TE الفلورسنت مزودة بكاميرا المسؤول عن جانب (CCD) الجهاز. تؤخذ الصور باستخدام الهدف 20X عن التكبير مجموعه 200X.
- تؤخذ الصور منفصلة عند التكبير نفسها التي استخدمت لدابي (200X) ، usinge الإضاءة فوق البنفسجية ، مع فلتر الاخضر لتصفية رودامين والأزرق للFITC. في وقت لاحق يتم دمج الصور باستخدام البرمجيات نيكون مجانية.
6. المزدوج على الأنسجة المناعية إعتبر كانساس والأنسجة ميكروأرس] كانساس لانا KSHV وماركر الخلية البطانية Pecam-1/cd31
- يتم تنفيذ المزدوج المناعية المسماة مع عدة داكو ABC strepavidin تلطيخ دويتو لLANA KSHV وهذه البروتينات موجودة في الخلية المضيفة تغير بعد الاصابة بالفيروس. يتم تنفيذ IHC على أنسجة الإيدز KS الأرشيفية ثابتة في الفورمالين ، وجزءا لا يتجزأ من البارافين.
- يتم قطع خمسة أقسام ميكرون مع مشراح ووضعها على الشرائح chemate قبل immunostaining.
- والبارافين deparaffinzed الشرائح المضمنة في الزيلين لمدة 10 دقائق تحت غطاء الدخان ، ثم الخلايا رطب في سلسلة متدرجة من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، 95 ٪ و 70 ٪ لمدة خمس دقائق لكل منهما. ثم توضع الشرائح في الماء لمدة 10 دقيقة قبل فضح مستضد (المعروف أيضا باسم استرجاع مستضد).
- لimmunostaining ، يتم تنفيذ فضح مستضد في فرن الميكروويف في 50 ملي العازلة سيترات 6.0 درجة الحموضة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لفترة وجيزة ، والشرائح التي تحتوي على خلايا وغرقت في 95 درجة مئوية لمدة العازلة سيترات 15 دقيقة ، ثم توضع فورا في الماء المقطر الذي عقد في درجة حرارة الغرفة.
- يتم تنفيذ التبريد من البيروكسيداز الذاتية التي يحتضنها الشرائح لمدة 30 دقيقة في محلول التبريد. لفترة وجيزة ، إضافة 47 مل من الايثانول 95 ٪ إلى أنبوب مخروطي 50 مل ، ويضاف 11.2 مل PBS درجة الحموضة 7.4 و 1.8 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ أي ما مجموعه 60 مل.
يتم تبريد المحلول فقط قبل استخدامه. - ثم يتم غسل الخلايا في درجة الحموضة 3X PBS 7.4 لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة. ويتم إعداد حل حجب (12.5 مل من الايثانول 95 ٪ ، و 1.4 مل من مصل الماعز العادي و 140 ملغ ألبومين المصل البقري ، و 2 قطرات توين 20) لمنع ملزم غير محدد من الأجسام المضادة. مكان على الجليد قبل الاستخدام. (يمكن تخزين هذا الحل حظر عند 4 درجة مئوية و لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع).
- حظر حل يضاف إلى العينة على الشريحة وتتناول ثم بشريط من البارافين (لتجنب تجفيف عينة) ووضعها في غرفة ترطيب والمحتضنة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- يتم تحضير الأضداد وحيدة النسيلة الأولية أو النسائل المتعددة للمستضد الفيروسية في عرقلة الحل في التخفيف 1:50 ، مختلطة مع ماصة ويوضع على الجليد لحين الحاجة إليها. وستكون هناك حاجة إلى 100 الخمسين ميكرولتر من محلول عينة الأنسجة في جسم تبعا لحجم العينات وعدد من الشرائح.
- مباشرة بعد حضانة تهتز الحل أغلقوا الشريحة ويضاف 5-10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية للعينات الأنسجة التي تغطيها ثم بشريط من البارافين. يتم تحضين العينات لمدة 1-2 ساعات في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة.
- الشرائح التي تحتوي على عينات من ثم يغسل 3X لمدة 5 دقائق في كل من درجة الحموضة 7.4 PBS الذي يضاف biotinylated الثانوية الماعز المضادة للجسم الفأر في تخفيف الحموضة في برنامج تلفزيوني 1:100 7.4 ، وحضنت في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 -- 45 دقيقة.
- حوالي 30 دقيقة قبل استخدام ، مستعدة البيروكسيداز مترافق - strepavidin درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني 7.4. باستخدام أدوات Cytomation ديو داكو ، بإضافة 50 ميكرولتر من محلول ألف إلى 5 مل من الرقم الهيدروجيني 7.4 PBS ، الدوامة ، ثم إضافة 50 ميكرولتر من الحل وباء المزيج مرة أخرى.
- بعد حضانة للأجسام المضادة في 6.10 في خطوة كاملة ، وتغسل الشرائح 3X درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني 7.4 ثم الأسبوعية طازجةيضاف epared الفجل البيروكسيداز مترافق - strepavidin الحل وحضنت في درجة حرارة الغرفة ل30-45 دقيقة في غرفة ترطيب.
- بعد الحضانة ، تغسل الشرائح 3X درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني 7.4 في درجة حرارة الغرفة. قبل خمس دقائق من اكتمال الغسيل ، 3 ، 3 - الركيزة حل diamino - البنزيدين (DAB ، SIGMA) (20 مل من 7.4 درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني ، 25 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ و 1 حبة DAB) مستعدة. بعد يذوب تماما قرص DAB ، يتم تصفية اللون البني حل من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون. ثم يتم إضافة الحل DAB تصفيتها إلى العينات بعد غسل النهائي لاحظت والتنمية لون LANA KSHV في الخلايا المصابة في الوقت الحقيقي تحت الإضاءة brightfield باستخدام المجهر الكسوف نيكون E200. حالما يتم تحقيق التنمية اللون المطلوب ، هو رد فعل من جانب تطفئ حضانة في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- المزدوج للIHC المسمى ، وبعد حضانة في الماء يتم وضع الشرائح التي تحتوي على عينات من خلال بروتوكول IHC للمرة الثانية اعتبارا من مستضد خطوة استرجاع (6.4). لكن التغييرات في بروتوكول البيروكسيداز خطوة الركيزة (6.11) في ذلك بدلا من الفجل البيروكسيداز يعمل مترافق - strepavidin ، والفوسفاتيز القلوية strepavidin المتقارن
- تحقق من الملصق الثانية التي يقوم بها خطوة إضافية استرجاع مستضد في الميكروويف على النحو الموصوف أعلاه ، بالإضافة إلى immunostaining الثانية مع ريتوكسيماب للبروتين خلوي تبين أن dysregulated (ناقلات مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا). يتم غسلها في وقت لاحق الخلايا ، وحضنت ثم مع biotinylated الضد الماعز مفتش anti-mouse/rabbit (داكو) في التخفيف 1:100 يعقبه المتقارن - strepavidin الفوسفاتيز القلوية (ناقلات مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) في التخفيف 1:500. ويتم تحقيق التنمية من قبل خلايا اللون يحتضنها مع الركيزة حمراء متجه باستخدام ناقلات الأحمر الركيزة الفوسفات القلوية مجموعة (ناقلات مختبرات ، بورلنجام ، كاليفورنيا) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تلطيخ العداد ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن يؤديها مع orecin أو الهيماتوكسيلين. ثم يتم عينات الأنسجة التي شنت وسائل الإعلام بشكل دائم مع permount المتصاعدة مع كوب الغطاء. تؤخذ الصور تحت إضاءة brightfield مع المجهر TE - 2000S نيكون مزودة كاميرا CCD.
7. تسليم الجينات التي كتبها اتش تنبيغ الخلايا DMVEC
- تزرع الخلايا الطبيعية DMVEC في الشرائح في طلاء الغرفة من 2.5 كثافة الخلايا 5 X10 في غرفة وسائل الاعلام EBM - 2 كاملة.
- تزرع الخلايا DMVEC لالتقاء 80 ٪ (مع 3-5 أيام) وبعد ذلك 5 / UL نافذة غرفة الشريحة من EGFP اتش في التعبير عن عيار 1X 10 10 الجسيمات / مليلتر.
- تم فحص الخلية الحية الثقافات DMVEC مع اتش المضافة لساعات EGFP 18 مضان بعد إضافة الفيروس.
- وقد اتخذت مرحلة الفردية والصور الفوتوغرافية الفلورسنت في التكبير مجموعه 200X ودمجها في المجهر NIKON 2000S TE الفلورسنت مزودة كاميرا CCD.
8. ممثل النتائج
الشكل 1. واستمرت الخلايا الأولية من شركة DMVEC Lonza في وسائل الإعلام EBM - 2 وكانت مصابة BCBL 1 - الفيروس في وزارة الداخلية من 0.01. وبعد فحص الخلية monolayers العدوى DMVEC اليومية. إصابة عشرة أيام آخر الخلايا المصابة وهمية تظهر الحصوه مثل التشكل والخلايا المصابة KSHV معارضها نوع الخلية مغزل مميزة مورفولوجيا الخلايا البطانية على شكل مغزلي وجدت مصابة KSHV في نسيج الورم كانساس. وقد التقط صورا مع مجهر NIKON 2000S TE مزودة كاميرا CCD في التكبير مجموعه 100X.
الشكل 2. تم تنفيذ المسمى غير المباشرة المزدوجة تلوين المناعي على الخلايا المصابة في KSHV DMVEC 10 إصابة آخر أيام. الخلايا المصابة كانت ملطخة المزدوج مع ريتوكسيماب إلى LANA KSHV والضد الماعز النسائل المتعددة للبروتين المضيف خلية معينة وجدت أن يتغير بعد الإصابة KSHV. وأضاف خليط من حمار الثانوية المضادة للماوس والحمار الأضداد المضادة للماعز مترافق لرودامين وFITC. تم فحص الخلايا تحت المجهر TE2000S نيكون الفلورسنت مزودة كاميرا CCD. واستخدمت وسائل الإعلام مع تصاعد دابي لتصور النوى. وقد اتخذت جميع الصور في التكبير مجموعه 200X. الخلية المصابة التعبير عن بروتين الفيروس LANA (رودامين الملون) مترجمة إلى نواة تبين انخفاض التعبير المضيف بروتين خلية معينة (FITC الملون) مترجمة إلى السيتوبلازم.
الشكل 3. IHC في أنسجة الورم لKS LANA وPECAM CD31 - 1 / الإيدز كانت ملطخة نسيج الورم KS بواسطة واحد والمزدوج لIHC المسمى LANA KSHV وPECAM 1 / CD31. أ) عروض KS الملون الأنسجة مع ريتوكسيماب إلى LANA وcounterstained مع الهيماتوكسيلين. ويتم تحديد الخلايا LANA الإيجابية التي السهام البيضاء. باء). KS الملون الأنسجة مع ريتوكسيماب إلى PECAMI/CD31 وتلطيخ يبدو محددة لبطانة الأوعية التي تصورها حول السهام البيضاء. C) يبين KS الملون الأنسجة المزدوج لLANA (ناقلات الحمراء) و CD31 (البني) التي تصورها لنا السهام السوداء للبيضاء للخلايا تلطيخ إيجابية لCD31. D) يظهر أقل مساحة من التكبير من نفس الشريحة في الصور لوحة Brightfield جيم صورت على المجهر TE2000S NIKON التكبير في مجموعه AC 600x و200X لوحة D.
الشكل 4. التعبير الزمني للLANA KSHV بواسطة qRT - PCR 10 إصابة آخر أيام مقارنة همية الخلايا المصابة السيطرة ، وتم تطبيع جميع القيم للخلايا المصابة إلى KSHV DMVEC GAPDH. لم يكن هناك أي دليل على التضخيم LANA [كدنا] في الخلايا المصابة وهمية.
الشكل 5. ميكروأرس KS نسيج الورم ، والأنسجة ميكروأري (TMA) تمثل 0.6 ملليمتر النوى الأنسجة المحتشدة على شريحة واحدة. كل نواة نسيج الورم يمثل عينة من مريض KS مختلفة. وأدلى TMA المتاحة من خلال عينة من الموارد لمكافحة السرطان مرض الإيدز (ASCR) من ليونا ايرز MD في جامعة ولاية أوهايو. وضعت جزءا لا يتجزأ من البارافين KS نسيج الورم المتطابقة مع أنسجة طبيعية وإيجابية السيطرة على الشرائح الزجاجية. وقد أخذت عينات الأنسجة KS من الفم والجلد واللهاة واللسان والرقبة والجماهير. وكان جميع المرضى بفيروس نقص المناعة البشرية.
الشكل 6. وكانت ملطخة ميكروأرس الأنسجة لLANA KSHV المناعية والتي تم تحليلها بواسطة المجهر brightfield. أجري التنمية للون مع LANA DAB باعتبارها الركيزة البيروكسيداز والخلايا LANA الإيجابية التي كانت تصور نمط تلوين البني مكثفة. ويمكن ملاحظة كميات مختلفة من العبء الفيروسي والمناطق الخلية المغزل. أ) تمثل عدوى فيروسية التنسيق في منطقة محددة من الورم. B) يمثل نشر عدوى فيروسية مع عبء العالية التي ترتبط تقريبا مع عدد من خلايا مغزلية الحالي. وقد لوحظت في الصميم نسيج ملون 200X التكبير.
الشكل 7. وtransduced الخلايا المزروعة في وسائل الإعلام DMVEC EBM 2 - الكامل في كثافة الخلايا 2.5 5 X10 لكل بئر مع 5 ميكرولتر من عيار اتش في 10 من 1.0X10. تم فحص خلايا لمضان EGFP تنبيغ آخر 18 ساعة. واتخذت كل من مرحلة والصور الفلورسنت على نيكون المجهر 2000S TE في التكبير مجموعه 200X. وقد ثبت من الخلايا ترنسفكأيشن DMVEC الأولية إلى أن إشكالية النواقل الفيروسية التي حددناها لذلك من شأنها أن تسمح لنا لتقديم fibulin - 2 و 3 - galetin بكفاءة عالية في DMVEC الابتدائي. وجدنا ان اتش EGFP يمكن التعبير عن كفاءة تنبيغ DMVEC الابتدائي. وجدنا أيضا أن ناقلات lentiviral التي حصلنا عليها من شركة Lentigen بالتساوي على درجة من الكفاءة لخلايا transducing DMVEC الابتدائي (لا تظهر البيانات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يمكن أن يؤديها المنهجيات المستخدمة في هذا التقرير في مجموعة متنوعة من البيئات المختبر. أنها تتطلب بعض المعدات الخاصة أو الوصول إلى المرافق الأساسية. يجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند القيام التجارب التي تنطوي على مسببات الأمراض الفيروسية المعدية مثل KSHV التي قد تتطلب استخدام مستوى biosaftey 3 (BSL - 3) المرافق. ويجب أيضا أن يكون الاستحواذ الأنسجة التي وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية المناسبة (IRBs).
يمكن أن توفر هذه المنهجيات معا أساسا لتحديد الجينات التي dysregulated في التعبير في المختبر ، وتوفير وسائل المعرفة من أجل التحقق من صحة في الجسم الحي من تغيير ملامح التعبير الجيني وكذلك استراتيجيات لتوصيل الجينات في خلايا بطانة الأوعية الدموية. قد تكون هذه النتائج مجتمعة تساعد على توضيح المسارات البيوكيميائية التي تأثرت KSHV والعدوى لاحقا من قبل جينات فيروسية معينة. يمكن فهم كيف مثل الفيروسات أنكجنيك KSHV المقاطعة المسارات الجزيئية تقدم أفكارا محددة في تطوير علاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر جيمس EK Hildreth ، ميهاري كلية الطب ، لتقديم المشورة له ومراجعة هذه المخطوطة. ونحن نشكر أيضا ديانا Marver للتحرير للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل مركز فاندربيلت ميهاري لأبحاث الإيدز (NIH منح AI054999 P30 - 05) ، ومركز للصحة الإيدز التفاوتات البحوث والمعاهد الوطنية للصحة منح 5U54 RR019192 - 05 ، ومركز للبحوث السريرية ميهاري ، NIH P20RR011792 غرانت ، والمعاهد الوطنية للصحة منح CA113239 P01. وقد مولت جزئيا من منح دجا التجريبية من مركز فاندربيلت ، ميهاري لأبحاث الإيدز (CFAR) ومركز للبحوث السريرية ميهاري (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
