Summary
Värdcellens faktorer spelar en avgörande roll i skapandet och upprätthållandet av Kaposis sarkom (KS). Vi kontur metoder för att identifiera faktorer värdcellen ändras hos KSHV-infekterade DMVEC celler, och i KS tumörvävnad. Cellulära gener förändras av viruset kommer att fungera som potentiella mål (ar) för nya behandlingar.
Abstract
För närvarande KS är den mest dominerande hiv / aids malignitet i södra Afrika och därmed världen. 1,2 Det karakteriseras som en angioproliferative tumör i vaskulära endotelceller och producerar sällsynta B-cells lymfoproliferativa sjukdomar i form av pleurautgjutning lymfom (PEL) och vissa former av multicentric Castleman sjukdom. 3-5 Endast 1-5% av celler i KS-lesioner aktivt stödja lytisk replikering av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV), den etiologiska agens i samband med KS, och det är klart att cellulära faktorer måste interagerar med virala faktorer i processen för onkogenes och tumörprogression. 6,7 Identifiera nya värd-faktor faktorer som bidrar till KS patologi är en förutsättning för att utveckla prognostiska markörer för tumörprogression och metastasering samt för att utveckla nya läkemedel för behandling av KS . 8 Den medföljande videon närmare de metoder vi använder för att identifiera värdcellen program genuttryck ändras dermal mikrovaskulära endotelceller (DMVEC) efter KSHV infektion och i KS tumörvävnad. 9 När oreglerad gener identifieras av microarray analys, förändringar i protein uttryck är bekräftats av immunoblot och dubbla märkt immunofluorescens. Förändringar i transkriptionell uttryck av oreglerad gener bekräftas in vitro av kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR). Validering av in vitro-fynd med hjälp av arkivens KS tumörvävnad är också utförs av dubbla märkt immunkemi och microarrays vävnad. Att identifiera oreglerad gener i KS tumörvävnad mikromiljö kommer att möjliggöra utvecklingen av in vitro och därefter in vivo modellsystem för 8,10 Vårt förhållningssätt upptäckt och utvärdering av potentiella nya behandlingsmetoder för behandling av KS.
Protocol
1. KSVH Odling och infektion i DMVEC
- Den BCBL-1 cellinje, ursprungligen isolerade från en mänsklig kropp hålighet baserat lymfom är odlade i fullständig RPMI 1640 medier (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 celler tas bort från flytande kväve, transporteras på torris, och snabbt tinade i 1 minut vid 37 ° C. En 50 mikroliter delprov av BCBL-1 celler med en täthet 1x10 4 celler / ml tillsätts till 500 ml RPMI 1640 medier kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 1x penicillin / streptomycin och distribueras till 175 cm flaskor på 50 ml / flaska .
- Kolvarna av BCBL-1 cellerna sedan inkuberas vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO 2 tills celltätheten nått 3x106 celler / ml. Lytisk cykel virusreplikation framkallas genom att lägga till TPA på 20ng / ml och natrium butyrate vid 0,3 ng / ml.
- Tjugofyra timmar efter induktion celler tvättas två gånger i PBS pH7.4 i en volym av 40 ml genom centrifugering vid 1500 rpm i en Sorvall Legend RT centrifug (för att avlägsna smörsyra) och induktion fortsätter med TPA på 20 ng / ml i RPMI 1640 i 5 dagar.
- Cell fri viruset har isolerats och koncentreras genom differential centrifugering. Kortfattat, celler och skräp är först pelleterat vid 10000 rpm i en Sorvall RC-6 Plus centrifugera vid 4 ° C i 30 minuter. Supernatanten som innehåller viruset tas bort och cellen gratis virus pelleterat i ett Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifugen vid 4 ° C under 1 timme vid 25.000 rpm.
- Den virusfria supernatanten tas bort och den virala pellets återsuspenderade i frysning media (10% dimetylsulfoxid och 90% fetalt kalvserum) och förvaras vid -80 ° C tills det behövs.
KSHV infektion av primär DMVEC celler. - DMVEC celler på nivå då 2-5 är pläterade med en initial täthet av 1 X 10 5 i 100x20mm rätter vävnadsodling eller diabilder kammare, och bibehålls i hela EMB-2 medier (Lonza, Basel, Schweiz) vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO 2. Vid 80% sammanflödet är DMVEC infekterade vid ett moi av 0,01, mock infekterad (medier) celler används som kontroller. Färska media läggs till cellerna var 2 dagar.
- DMVEC cell monolager och diabilder kammare undersöks dagligen för tecken på infektion som noterades av spindel cell bildas. Efter det första tecknet på spindel cell formation (7-14 dagar) vi sluta medier förändringar. Dock kan längre inkubationstiderna än 15-21 dagar utan att ge nya medier äventyra integriteten i DMVEC celler resulterar i celler dör eller lyfta av kulturen skålen.
- Vid den punkt av maximal spindling vid infektion, är cellen monolager skördas för beredning av cellens pellets för protein eller RNA-extraktion. Infekterade DMVEC celler kammare bilderna tvättas två gånger med 1 ml / fönster med förvärmda PBS pH 7,4. Celler på kammaren bilderna skördas efter tvätt 2X med PBS pH 7,4. Tillät dem att torka helt innan du tar bort kamrarna och placera bilderna i 100% metanol som hölls vid -20 ° C tills det behövs för immunofluorescens färgning (IFA).
2. Total RNA Isolering och produktion av cDNA från Mock och KSHV Infekterade DMVEC
- Total RNA extraheras från KSHV-smittade DMVEC och håna infekterade celler med hjälp av en Qiagen RNesay Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Tillverkarens protokoll för bearbetning av animalisk vävnad är anställd men utan homogenisering stegen, om odlade celler är den källa som används för RNA isolering.
- Välj det alternativ som erbjuds för att behandla RNA med DNAseI på kolumnen med Qiagen RNA fria DNAse Kit, enligt tillverkarens rekommendationer finns i bilaga till bruksanvisningen. DNAaseI degraderar eventuella kontaminerande genomiskt eller viralt DNA från RNA förberedelser. Den DNAseI behandling är avgörande för nedströms applikationer inklusive RT-PCR, QRT-PCR och microarray-analyser.
- RNA tvättas enligt anvisningar och alla rester av etanol i tvättbufferten avlägsnas genom centrifugering kolumnen ett mer tid än som föreslås av tillverkaren. Kvarvarande etanol äventyrar renhet RNA efter eluering.
- Efter den sista tvätten en extra centrifugering steg utförs innan RNA kan elueras från kolonnen. RNA elueras från kolonnen med 30 mikroliter av RNAse fritt vatten. RNA är då kvantifieras och analyseras för renhet på ett Eppendorf AG-6131 Bio-fotometer. Den optiska densitet (260/280 nm) bör between1.8-2.0 som är typisk för RNA med hög renhet.
- För microarray analys är RNA analyseras på en Agilent 2100 Bioanalyzer med RIN programvaran algoritm. Analysen på bioanalyzer ger dig en RNA Integrity Number (RIN) från 1-10, har dock RIN nummer 7-10 visat sig ge konsekventa och mer tillförlitliga resultat för microarray eller QRT-PCR-analyser. Det genomsnittliga RIN-nummer för RNA isolaTed med Qiagen RNAeasy kit i våra händer sträcker sig från 7,5 till 9.
- Kvantifiering av RNA uppnås genom att tillsätta 1 ìl av elueras RNA från kolumnen till 99 mikroliter 10 mM Tris-EDTA pH 7,6. RNA och buffert blandas med en pipett och lagt till ett rent kyvett För spektrofotometri med en Eppendorf Bio-fotometer.
- Budbärar-RNA i ett mikrogram av varje prov är laddad med slumpmässiga hexamerer tillhandahålls av tillverkaren, innan omvänd transkription med hög kapacitet cDNA omvänd transkription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA.).
cDNA syntes - Att syntetisera enkelsträngad cDNA från total RNA använder vi en hög kapacitet cDNA Kit omvänd transkription från Applied Biosystems och fortsätt enligt tillverkarens anvisningar.
- En 2x Master Mix av reagens sker och 0,5 till 1 mikrogram av RNA i en volym av 10 mikroliter läggs till 10 mikroliter av 2x mästare reagens blandas. Den resulterande 1x Lösningen är lätt blandas och omvänd transkription sker i en BIORAD MJ Mini-Themal apparat enligt tillverkarens anvisningar.
- Upp till två mikrogram totala RNA kan användas per 20 mikroliter reaktion. Den cDNA är kvantifieras vid 260 nm i ett Eppendorf AG-6131 Bio-Fotometer, och förvaras vid -80 ° C tills det behövs för QRT-PCR.
3. Microarray jämförande analysen av Mock och KSHV Infekterade DMVEC celler
Vårt laboratorium utför microarray analys vid Vanderbilt University Medical Center Microarray Delad Resource Core Facility på en avgift-for-service basis. Vi jämför utdatafiler för transkriptionell dysreglering av gener i KSHV infekterade DMVEC celler att håna infekterade styra celler. Transkriptionell oreglerad gener i KSHV infekterade celler som är relevanta för angiogenes, celltillväxt eller som representerar metastaserande biomarkörer är validerade in vitro med hjälp av KSHV infekterade DMVEC celler med realtid PCR, Western blotting och dubbla IFA; resultat jämförs med resultaten i arkiv KS tumör vävnad.
4. Kvantitativa RT-PCR transkriptionella Analys oreglerad gener som finns i Mock-och KSHV-infekterade DMVEC
- Real Time PCR utförs i 96 och optiska skivor (Sorenson Bioscience, Inc.) med omvänt transkriptas genereras cDNA från en renade RNA prov och med hjälp av en MyiQ Enkel färg Real Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) och 25 mikroliter reaktion volymer. Detta förfarande sker i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika eventuell förorening med främmande DNA / cDNA som kan finnas i rummet.
- En Master Mix är upprättad i 1,5 ml rör för varje grundfärg som (enligt tillverkarens anvisningar) med SYBR Grön Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) och utvalda framåt och bakåt grundfärger för varje gen, vid en koncentration av 250 nm per brunn, tillverkad i RNAase DNAase fria H 2 O. Varje prov ska göras i tre exemplar.
- Primer sekvenser för QRT-PCR för gener värdcellen ingår primer sekvenser för KSHV Lana, som är det virus latens tillhörande nukleära antigen som är mycket uttrycks i KSHV infekterade DMVEC celler och KS tumörer.
- Den 10 ng / ul cDNAs lager från håna infekterade och KSHV infekterade DMVEC celler är spädd 1:3 med RNAase DNAase fria H 2 O, 3μL av denna spädning tillsätts till varje brunn. Kontrollbrunnarna ersätta vatten till cDNA.
- Den 96 brunnar tätas med optisk isoleringstejp (Bio-Rad Laboratories), försiktigt blandad och centrifugeras i 2 minuter vid 1000 rpm, rumstemperatur, för att samla reaktionsblandningen i botten av brunnarna. Bio-Rad MyiQ Detection System och lampan slås på vid denna tid för att möjliggöra en 10 minuters uppvärmning tid innan loppet.
- Den centrifugeras 96 brunnar sedan sätts i en Bio-Rad M iQ Enkel färg Real Time PCR Detection System, in programmet för cykeln sekvenser och sparas och köra igång.
- Den cykling sekvensen som följer: 95 ° C i 3 minuter, 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C under 1 minut, 95 ° C under 1 minut, 55 ° C under 1 minut och 55 ° C i 30 sekunder för 81 cykler totalt. En smälta kurva ingår i det här programmet som en check på primer effektivitet. En GAPDH primer som är förstärkt, och ingår för normalisering.
- Dataanalys sker med Bio-Rad iQ5 Optical System Software Version 2.
5. Dubbla Märkta Immunfluorescens Analys av KSHV Infekterade DMVEC celler
- Avdelningen diabilder (bort från kamrarna) som innehåller både konfluenta infekterade och oinfekterade DMVEC tvättas två gånger med PBS pH 7,4, torkad luft och fast i -20 ° C före kylda absolut metanol i 10 minuter och hålls vid -20 ° C.
- Diabilder med celler thsv lufttorkade i 15 minuter, och placeras i en Coplin burk på is som innehåller Tris saltlösning (0,05 Tris pH 7,4) i 5 minuter. Cellerna inkuberas därefter i 1 timme vid 37 ° C i en fuktig kammare med en blandning av monoklonala antikroppar mot KSHV LANA på en 1:50 spädning i PBS pH 7,4 (Vector Laboratories, San Francisco) plus en get polyklonala antikroppar (1: 100 utspädning i PBS pH 7,4) mot värdlandet faktorn proteinet visade sig vara dyregulated med microarray använda KSHV infekterade DMVEC celler.
- Cellerna är sedan tvättas 3x med Tris koksaltlösning (aldrig låta cellerna att torka ut) och sedan inkuberas i 30 minuter med en blandning av en sekundär åsna anti-mus-IgG-antikropp konjugerad med Rhodamine röda X och åsna anti-get antikropp konjugerad med FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), både på en 1:100 utspädning i PBS.
- Cellerna är sedan tvättas 3x i Tris saltlösning i en Coplin burk och medan bilderna fortfarande är fuktig, är bilderna monteras med Vectashield montering media (Vector Laboratories, San Francisco) som innehåller 1,5 g / mL DAPI och ett täckglas.
- Fluorescens observeras och bilder fotograferade med en Nikon TE 2000S fluorescerande mikroskop monteras med en charge-coupled device (CCD) kamera. Fotografierna är tagna med en 20x mål för en total förstoring på 200x.
- Separata bilder på samma förstoring som används för DAPI (200x), tas belysning usinge UV, med en grön filter för Rhodamine och en blå filter för FITC. Bilderna gick senare samman med Nikons freeware programvara.
6. Dubbla Märkt Immunohistokemi på Ks Tissue och Ks Microarrays Mjukpapper för KSHV Lana och endotelceller Marker Pecam-1/cd31
- Dubbla märkt immunohistokemi utförs med DAKO strepavidin ABC duett färgning kit för KSHV Lana och de som värd proteiner som cellen befunnits ändrats efter virusinfektion. IHC utförs på arkivens AIDS-KS vävnad fixerades i formalin, och inbäddade i paraffin.
- Fem mikron delar är skurna med en mikrotom och placeras på chemate diabilder före immunfärgning.
- Paraffininbäddade bilder är deparaffinzed i xylen i 10 minuter under ett dragskåp och sedan celler hydratiserade i en graderad etanol serie 100%, 95% och 70% i fem minuter vardera. Diabilder placeras sedan i vatten i 10 minuter innan antigen avslöja (även känd som antigenåtervinning).
- För immunfärgning är antigen avslöja utförs i en mikrovågsugn i 50 mm citrat pH 6,0 buffert vid 95 ° C i 15 minuter. Kortfattat, diabilder som innehåller celler är nedsänkt i 95 ° C citratbuffert i 15 minuter, sedan omedelbart placeras i destillerat vatten förvaras i rumstemperatur.
- Härdning av endogent peroxidas utförs genom inkubering diabilder i 30 minuter i en släcka lösning. Kortfattat, tillsätt 47 ml 95% etanol till ett 50 ml koniskt rör, tillsätt 11,2 mL PBS pH 7,4 och 1,8 ml 3% väteperoxid för totalt 60 ml.
Den släcka lösning gjorts strax före användning. - Cellerna är sedan tvättas 3x i PBS pH 7,4 i 5 minuter vardera i rumstemperatur. En blockerande lösning (12,5 ml 95% etanol, 1,4 ml normal get serum, 140 mg bovint serumalbumin, och 2 droppar Tween 20) är beredd att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar. Placera på is före användning. (Detta blockerande lösningen kan förvaras vid 4 ° C och upp till 1 vecka).
- Blockering tillsätts till provet på bilden och täcks sedan med en remsa av paraffin (för att undvika uttorkning av prov) och placeras i fuktig kammare och inkuberas under 1 timme i rumstemperatur.
- Den primära monoklonala eller polyklonala antikroppar till virusantigen är beredd att blockera lösning vid en 1:50 spädning, blandat med en pipett och placeras på is tills det behövs. Femtio till 100 mikroliter av antikroppar lösning kommer att behövas per vävnadsprov beroende på storleken på proverna och antalet bilder.
- Omedelbart efter inkubation den blockerande lösningen skakas från glaset och 50-100 mikroliter av den primära antikroppen läggs till i vävnadsprov som sedan täcks med en remsa av paraffin. Prover inkuberas i 1-2 timmar i en fuktig kammare vid rumstemperatur.
- Bilder som innehåller prover tvätta sedan 3x i 5 minuter vardera i PBS pH 7,4 till vilken tillsätts en sekundär biotinylerad get-anti-mus antikropp på en 1:100 utspädning i PBS pH 7,4, och inkuberas i fuktig kammare i rumstemperatur i 30 - 45 minuter.
- Cirka 30 minuter innan den används, är peroxidas konjugerat-strepavidin i PBS pH 7,4 förberedd. Använda DAKO Cytomation Duet Kit, tillsätt 50 mikroliter av lösning A och 5 mL PBS pH 7,4, virvel, och lägg sedan till 50 mikroliter av lösning B och blanda igen.
- Efter antikroppen inkubationen i steg 6,10 i fullständig, är bilderna tvättas 3x i PBS pH 7,4 och sedan nyligen prepared pepparrotsperoxidas konjugerad-strepavidin tillsätts och inkuberas i rumstemperatur i 30-45 minuter i en fuktig kammare.
- Efter inkubation, är bilderna tvättas 3x i PBS pH 7,4 vid rumstemperatur. Fem minuter innan tvätten är klar 3, 3-diamino-benzidin (DAB, SIGMA) substratlösning (20 mL PBS pH 7,4, 25 mikroliter med 3% väteperoxid, och en DAB-tablett) är beredd. När DAB-tabletten är helt upplöst, är brunaktig färgade lösningen filtreras genom ett 0,45 micron spruta filter. Den filtrerade DAB lösningen läggs sedan till de förlagor efter den sista tvätten och färg utveckling för KSHV Lana i infekterade celler har observerats i realtid i brightfield belysning med hjälp av en Nikon Eclipse E200 mikroskop. När önskad färg utveckling uppnås, är reaktionen släcks genom inkubering i destillerat vatten i 5 minuter.
- För dubbla märkt IHC, efter inkubation i vattnet bilderna innehåller exemplar sätts via IHC-protokollet för andra gången med början antigenåtervinning steg (6,4). Men protokollet förändringar på peroxidas substratet steg (6,11) i stället för den pepparrotsperoxidas konjugerad-strepavidin, ett alkaliskt fosfatas strepavidin konjugat är anställd
- Den andra märkningen uppnås genom en extra antigenåtervinning steg i mikrovågsugn enligt ovan plus ett andra immunfärgning med en monoklonal antikropp mot den cellulära proteinet visade sig vara oreglerad (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Celler är därefter tvättas, och sedan inkuberas med en biotinylerad get anti-mouse/rabbit IgG-antikroppar (DAKO) vid en 1:100 spädning följt av en alkalisk fosfatas-strepavidin konjugat (Vector Labs, Burlingame, CA) vid 1:500 spädning. Färg utveckling uppnås genom att inkubera celler med underlaget vektor röda med en Vector Red alkaliska kit fosfat substrat (Vector Laboratories, San Francisco) enligt tillverkarens anvisningar. Counter färgning, om så önskas, kan utföras med orecin eller hematoxylin. Vävnadsprover sedan fast monterad med permount montering media med ett skyddsglas. Bilderna är tagna i brightfield belysning med en Nikon TE-2000S mikroskop monteras med en CCD-kamera.
7. Gene Leverans av Adenovirus Transduction av DMVEC celler
- Normala DMVEC cellerna odlas i kammaren diabilder på bordläggning av densitet 2,5 X10 5 celler per kammare EBM-2 komplett media.
- DMVEC celler odlas till 80% sammanflödet (tar 3-5 dagar) efter vilken 5 ul / kammare skjut fönster adenovirus uttrycka EGFP på en titer 1X 10 10 partiklar / ml.
- Live DMVEC cellkulturer med Adenovirus läggas undersöktes EGFP fluorescens 18 timmar efter att du lagt viruset.
- Individuell fas och fluorescerande bilder togs vid en total förstoring av 200X och samman på en Nikon TE 2000S fluorescerande mikroskop monteras med en CCD-kamera.
8. Representativa resultat
Figur 1. Primär DMVEC celler från Lonza Corporation bibehölls i EBM-2 media och var infekterade med BCBL-1-virus på ett moi på 0,01. Efter infektion DMVEC cell monolager undersöktes dagligen. Tio dagar efter infektion håna infekterade celler visar en kullersten-liknande morfologi och KSHV infekterade celler uppvisade en spindel celltyp morfologi kännetecknande för spindel formade endotelceller fann infekterade med KSHV i KS tumörvävnad. Fotografier tagna med en Nikon TE 2000S mikroskop monteras med en CCD-kamera till en total förstoring 100X.
Figur 2. Dubbla märkt indirekt immunofluorescens färgning utfördes på KSHV infekterade DMVEC celler vid 10 dagar efter infektion. Infekterade celler dubbla färgas med en monoklonal antikropp mot KSHV LANA och en get polyklonala antikroppar till ett specifikt värdcell protein som finns att ändras efter KSHV infektion. En blandning av sekundära åsna anti-mus och åsna anti-get-antikroppar konjugerade till Rhodamine och FITC lades till. Celler undersöktes med en Nikon TE2000S fluorescerande mikroskop utrustad med en CCD-kamera. Montering media med DAPI användes för att visualisera kärnor. Alla bilder togs vid en total förstoring på 200x. Infekterade celler som uttrycker viruset LANA protein (Rhodamine färgas) lokaliserade till cellkärnan visa minskat uttryck av värdcellen specifikt protein (FITC färgas) lokaliserad till cytoplasman.
Figur 3. IHC i KS tumörvävnad för Lana och PECAM-1 / CD31. Aids KS tumörvävnad var fläckad av enkla och dubbla märkt IHC för KSHV Lana och PECAM-1 / CD31. A) visar KS vävnad färgas med en monoklonal antikropp till Lana och counterstained med hematoxylin. LANA positiva celler identifieras med vita pilar. B). KS vävnad färgas med en monoklonal antikropp mot PECAMI/CD31 och missfärgning verkar specifika för endotelceller runt fartyg skildras med vita pilar. C) Visar KS vävnad dubbla färgade för Lana (vektor röd) och CD31 (brun) skildras av svarta pilar för Lana en vit för celler färgning positiva för CD31. D) Visar en lägre förstoring av ett område från samma bild i panelen C. brightfield bilder fotograferades på en Nikon TE2000S mikroskop på totalt förstoring av 600x AC och 200x för panelen D.
Figur 4. Temporal uttryck för KSHV LANA med QRT-PCR 10 dagar efter infektion jämfört med håna infekterade styra celler. Alla värden för KSHV infekterade DMVEC celler normaliserades till GAPDH. Det fanns inga tecken på LANA cDNA förstärkning i mock infekterade celler.
Figur 5. KS tumörvävnad mikroarrayer. Den tissue microarray (TMA) är 0,6 millimeter vävnad kärnor klädd på en enda bild. Varje vävnad kärna representerar en KS tumör exemplar från en annan patient. TMA gjordes tillgängliga via aids Cancer Specimen Resurs (ASCR) från Leona Ayers VD vid Ohio State University. Paraffininbäddade KS tumörvävnad tillsammans med matchande normal och positiv kontroll vävnader placerades på objektglas. KS vävnadsprover togs från mun, hud, mjuka gommen, tunga och massor hals. Alla patienter var HIV-positiva.
Figur 6. Tissue microarrays färgades för KSHV LANA med immunhistokemi och analyserades av brightfield mikroskopi. Färgutvecklingen för Lana utfördes med DAB som peroxidas substrat och Lana positiva celler var visualiseras genom en intensiv brun färgning mönster. Olika mängder av viral belastning och spindel regioner cellen kan observeras. A) representerar fokus virusinfektion i definierade regionen av tumören. B) utgör sprids infektion med hög virus börda som grovt är korrelerad med antalet spindeln celler närvarande. Målat vävnad kärnor observerades vid 200x förstoring.
Figur 7. DMVEC celler odlas i EBM-2 komplett media med en täthet av 2,5 X10 5 celler per brunn var transduced med 5 mikroliter av Adenovirus på en titer av 1.0X10 10. Celler undersöktes EGFP fluorescens 18 timmar efter transduktion. Både fas och fluorescerande bilder är tagna på en Nikon TE 2000S mikroskop till en total förstoring 200X. Transfektion av primär DMVEC celler har visat sig vara problematiskt därför har vi identifierat virala vektorer som ger oss möjlighet att leverera fibulin-2 och galetin-3 mycket effektivt i de primära DMVEC. Vi fann att ett adenovirus uttrycka EGFP effektivt kan transduce primära DMVEC. Vi fann också att Lentiviral vektor vi fått från Lentigen Corporation var lika effektiv för transducing primära DMVEC celler (data visas inte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som används i denna rapport kan utföras i olika laboratorium inställningar. De kräver någon speciell utrustning eller tillgång till grundläggande faciliteter. Lämpliga försiktighetsåtgärder måste vidtas när man gör experiment med smittsam virussjukdom patogener som KSHV som kan kräva användning av en biosaftey nivå 3 (BSL-3) anläggningar. Tissue förvärv måste också godkännas av lämpliga institutionella prövningsnämnder (IRBs).
Dessa metoder tillsammans kan ge en grund för att identifiera gener som är oreglerad i uttryck in vitro och ger definierade metoder för in vivo validering av förändrade genuttrycksprofilerna samt strategier för genen leverans i endotelceller. Dessa fynd tillsammans kan bidra till att belysa biokemiska vägar som påverkas av KSHV infektion och därefter av specifika virala gener. En förståelse för hur onkogena virus som KSHV avbryta specifika molekylära vägar kan ge insikter i utvecklingen av nya behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar James EK Hildreth, Meharry Medical College, för hans råd och översyn av detta manuskript. Vi tackar också Diana Marver för redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av Meharry Vanderbilt Centrum för AIDS-forskning (NIH bevilja P30 AI054999-05), Centrum för aids skillnader i hälsa Forskning, NIH bevilja 5U54 RR019192-05, den Meharry Centrum för klinisk forskning, NIH Grant P20RR011792, och NIH bevilja P01 CA113239. DJA delvis finansierats av piloten bidrag från Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) och Meharry Centrum för klinisk forskning (CRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| EBM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | + bullet kits supplement |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA |
| Mounting media | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield with DAPI |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Western substrate | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotin-rabbit-anti goat | Dako | 305-065-045 | |
| AP-Strepavidin conj. | Dako | K 0492 (kit) | |
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | |
| TE 2000S Fluorescent microscope | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
