Summary
In questo articolo, mostriamo un metodo per fare gli aghi capillare di vetro con un 50-micron lumen. Questa tecnica riduce in modo significativo il danno al cervello, riduce al minimo la diffusione passiva di farmaci e permette una mira precisa nel cervello dei roditori.
Abstract
Microiniezioni nel parenchima cerebrale sono importanti procedure per la fornitura di farmaci, vettori virali o trapianti di cellule. La lesione del cervello che produce l'iniezione di un ago durante la sua traiettoria è una delle principali preoccupazioni soprattutto nel cervello di topo non solo per il cervello è piccolo, ma a volte anche iniezioni multiple sono necessari. Mostriamo qui un metodo per produrre aghi capillare di vetro con un 50-micron lume che riduce significativamente i danni cerebrali e permette una mira precisa nel cervello dei roditori. Questo metodo permette una consegna di piccoli volumi (da 20 a 100 Nl), riduce i rischi di sanguinamento, e riduce al minimo la diffusione passiva dei farmaci nel parenchima cerebrale. Usando diverse dimensioni di tubi di vetro capillari, o cambiando il lume ago, diversi tipi di sostanze e cellule possono essere iniettato. Microiniezioni con un tubo capillare di vetro rappresentano un significativo miglioramento nelle tecniche di iniezione e cerebrale profonda targeting con danni collaterali minimi in piccoli roditori.
Protocol
- Fai aghi di vetro prima dell'intervento del mouse:
- Mettere il tubo capillare di vetro in un estrattore micropipetta.
- Di calore al centro del tubo di vetro per ammorbidire il tubo di vetro nella zona localizzata.
- Allungare il tubo di vetro lungo il suo asse longitudinale da una distanza iniziale sufficiente per causare una riduzione del diametro del tubo di vetro nella zona localizzata.
- Tenere il tubo di vetro che si estende fino a quando non si rompe. In questo modo, due aghi identici canna singola si ottengono.
- Mettere l'ago di vetro in un microforge. Un angolo di 30 ° è sufficiente per smussare la punta.
- Controllare al microscopio che ogni ago è il diametro corretto interiore. Per la maggior parte dei farmaci idrofili uno 30-50 micron di diametro interno è l'ideale (figura 1).
- Riempire l'ago con olio minerale dalla fine della più ampia ago di vetro. Lasciate che l'olio minerale (scheda di sicurezza, cat. M7700) entra per capillarità fino a raggiungere circa il 50% della lunghezza del tubo capillare. Mettere alto vuoto grasso (Dow Corning, cat. 05.054-AB) attorno al pistone per sigillare la più ampia fine dell'ago.
- Inserire il pistone dalla più ampia fine dell'ago e spingere delicatamente l'olio minerale fino ad una piccola goccia di olio è visto uscire la punta di un ago di vetro.
- Fissare l'ago di vetro nel supporto del microinjector.
- Anestetizzare il mouse con il 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoethanol + terz-amilico, 1:1 w / v). Dosis 25-30μL per grammo intraperitoneale.
- Mettere un pad riscaldatore sul dispositivo stereotassico per mantenere la temperatura del corpo dell'animale a 37 ° C.
- Posizionare e fissare il capo del mouse sul dispositivo stereotassica con barre orecchio e un supporto denti.
- Pulire la testina mouse con soluzione di clorexidina gluconato 0,1%, seguito dal 70% etanolo e gluconato di clorexidina 0,1% per la seconda volta.
- Incise la pelle con una lama chirurgica # 15 da orecchie del mouse per la linea cranio Lamba.
- Lucidare il cranio con uno swap di cotone ad asciugare fuori e tirare la pelle fuori del campo chirurgico.
- Utilizzare la punta di un ago di vetro per puntare al vertice della sutura bregma. Ci si deve impostare la posizione iniziale di iniettori (punto "zero").
- Impostare il punto da forare spostando la "X" e "Y" del dispositivo stereotassica sopra il cranio.
- Praticare molto attentamente i fori al di coordinate selezionato. Microdrills e altri oggetti metallici, sono stati precedentemente sterilizzati a 250 ° C per 60 secondi con un secco perle di vetro sterilizzatore (Cole Palmer, cat. No. EW-10779-00).
- Con una pinza sottile rimuovere con attenzione lo strato più profondo delle ossa e rompere la membrana duramatter (potrete vedere alcune fluido cerebro-spinale fuoriesce).
- Verificare che l'ago può passare attraverso fori.
- Pipettare 1 ml di farmaco da iniettare e metterlo su un piccolo pezzo di parafilm.
- Mettere il parafilm sul cranio.
- Aspirare il farmaco facendo girare la ruota microinjector, mentre si verifica al microscopio che il fluido è in costante aumento nella ago di vetro.
- Rimuovere il parafilm e re-impostare la coordinata zero.
- Spostare l'ago alle coordinate selezionato, in basso il supporto fino a quando la punta dell'ago vetro toccare delicatamente la superficie del cervello e impostare la coordinata "Z" a zero.
- Introdurre l'ago di vetro nel parenchima cerebrale in profondità selezionata.
- Iniettare il farmaco lentamente a ritmo di ~ 1 nl / sec.
- Quando il volume desiderio viene iniettato, lasciare che il farmaco diffuso nel parenchima per 2 minuti. Quindi procedere per rimuovere l'ago senza intoppi e lentamente.
- Incollare la ferita chirurgica e rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico e mettere l'animale in un pre-riscaldato gabbia contenente un letto pulito per il recupero anestesia.
- Per fornire analgesia post-operatoria tutti gli animali hanno ricevuto 5 mg / kg per via sottocutanea Ketorolac ogni 12 ore per 24 ore
Rappresentante dei risultati:
Quando si segue questo protocollo, un'iniezione molto preciso e si ottiene una pista ago molto sottile minimizza lesioni cerebrali. Come risultato rappresentativo di questo metodo, abbiamo iniettato lysophosphatidyl colina (lisolecitina) nel corpo calloso che produce demielinizzazione dei tratti di sostanza bianca 1-4. Per minimizzare il danno prodotto dal cervello l'ago di vetro, abbiamo iniettato solo 20 nl di lisolecitina nel corpo calloso, ma se i volumi di richieste superiori fino al 200 nl può essere iniettata con lo stesso metodo. Demielinizzazione viene rilevato dalla assenza di espressione della proteina basica della mielina nei tratti di sostanza bianca (Figura 2).
Figura 1. Un ago vetro con un diametro di 50 micron. Distanza tra due tick brevenella scala rappresenta una lunghezza di 50 micron.
Figura 2. Iniezione Lysolecithin nel corpo calloso. Demielinizzazione è mostrato come un no espressione della proteina basica della mielina (area tratteggiata). Si noti la piccola dimensione del tratto ago di vetro (frecce). Bar = 100 micron
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Discussion
Il metodo mostrato in questo video è molto utile per fornire la maggior parte dei farmaci o vettori virali in luoghi molto preciso nel cervello. Alcuni dei principali vantaggi di questa tecnica sono l'affidabilità del punto di misura, l'accuratezza delle iniezioni e le piccole dimensioni della lesione cerebrale e danni tratto 1, 2, 5, 6. Una volta che la tecnica è standardizzata la gamma di mistargeting deve 50 micron o meno 1, 2. Trapianti di cellule può essere effettuata anche utilizzando più ampio, 100-150 micron 7-9, aghi. Consegna delle cellule quindi efficiente può essere depositato in molto specifiche lesione riducendo al minimo i danni collaterali indotti da trapianto di cellule. Ci sono tre passaggi fondamentali di questa tecnica:
- Raccomandiamo sempre graffiare dolcemente il cranio con un ago da insulina per etichettare le coordinate selezionato prima di forare.
- Introdurre l'ago di vetro con un rapido movimento di penetrare rapidamente la superficie del cervello.
- Una volta che la profondità ottimale si raggiunge si dovrebbe introdurre l'ago 0,1 millimetri più in profondità nel parenchima cerebrale per fare un "canale" che permettono di diffondere liberamente della droga nel cervello.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
OG-P è stato sostenuto da CONACyT s borsa (CB-2008-101476) e FRABA (686/10). AQ-H supportati dal National Institute of Health, l'Howard Hughes Medical Institute, la Robert Wood Johnson Foundation e della Fondazione cellule staminali Maryland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary glass tube | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| Micropipette puller | Kopf Instruments | Model 730 | |
| Microforge | World Precision Instruments, Inc. | Model 48000 | |
| Mineral oil | MSDS | M7700 | |
| High-vacuum grease | Dow Corning | 05054-AB | |
| Anesthesia: 2.5% Avertin | 2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v | ||
| Heater pad | Mastex | Model 900 | |
| Stereotactic device | Kopf Instruments | Model Kopf-900 | |
| Surgical scalpel blade # 15 | Medi-Cut | ||
| Micro driller | Ideal Micro Drill | 67-1000 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | ||
| 1-μL Micropipette | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | Vasiorkop with Contraves system | |
| Microinjector | Narishige International | Model MO-10 |
References
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