Summary
이 문서에서는, 우리는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 크게, 뇌 손상을 감소 약물의 수동적 확산을 최소화하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수 있습니다.
Abstract
뇌 실질에 Microinjections 마약, 바이러스성 벡터 또는 세포 이식을 전달하는 것이 중요 절차입니다. 주사 바늘는 궤도 도중에 생성되는 뇌 병변뿐만 아니라 두뇌가 작은뿐만 아니라 때로는 여러 개의 주사가 필요합니다 특히 마우스 두뇌의 주요 관심사입니다. 우리는 여기서 크게 뇌 손상을 감소하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수있는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을 생산하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 작은 볼륨의 전달 (20-100 NL에서)는, 출혈 위험을 줄일 수 있도록하고, 뇌 실질 조직에 약물의 수동적 확산을 최소화합니다. 모세관 유리 튜브의 다른 크기를 사용하거나 바늘 루멘을 변경하여, 물질과 세포의 여러 종류의 주입 수 있습니다. 유리 모세관과 Microinjections는 분사 기술과 소형 설치류에 최소한의 피해 타겟팅 깊은 두뇌에 상당한 개선을 나타냅니다.
Protocol
- 마우스 수술 전에 유리 바늘 만들기 :
- micropipette의 풀러의 모세관 유리 튜브를 넣어.
- 지역화된 영역의 유리 튜브를 부드럽게하는 유리 튜브의 가운데를 열.
- 지역화된 영역의 유리 튜브의 직경의 감소를 일으킬 수있는 충분한 초기 거리하여 세로 축을 따라 유리관을 스트레치.
- 그것이 휴식 때까지 유리 튜브를 스트레칭 유지. 이런 방식으로 두 개의 동일한 하나의 배럴의 바늘은 얻을 수 있습니다.
- microforge에 유리 바늘을 넣어. 30 ° 각도만큼 베벨 팁을하는 것입니다.
- 각각의 바늘이 정확한 내경을 가지고있는 현미경으로 확인합니다. 친수성 약물의 대부분 30-50 μm의 내경은 (그림 1) 이상적인 제품입니다.
- 유리 바늘의 넓은 끝에서 광유로 바늘을 입력합니다. 그걸로 모세관 튜브의 길이의 ~ 50 %에 도달할 때까지 미네랄 오일 (MSDS, 고양이. M7700) 모세관 현상에 의해 입력하자. 입어 높은 진공 바늘의 넓은 끝을 밀봉하는 플런저 주변 그리스 (다우 코닝, 고양이. 05054 - AB).
- 바늘의 넓은 말까지 플런저를 넣고 기름의 작은 방울이 유리 바늘 끝을 들락날락 때까지 부드럽게 미네랄 오일을 밀어.
- microinjector의 소유자에 유리 바늘을 고정합니다.
- 2.5 % Avertin (2,2,2 - tribromoethanol + tert - 아밀 알코올, 1시 1분 W / V)와 마우스를 마취. Dosis g intraperitoneal 당 25 30μL.
- 37 동물의 체온을 유지하는 stereotactic 장치 ° C.에 히터 패드를 넣어
- 장소 및 귀 바, 치아 홀더를 사용하여 stereotactic 장치에서 마우스 머리를 확보.
- 두 번째 시간을 70 % 에탄올과 0.1 % Chlorhexidine 글루 콘 산 다음에 0.1 % Chlorhexidine 글루 콘 산 솔루션으로 마우스 머리를 청소하십시오.
- Lamba 스컬 라인에 마우스 귀를에서 수술 블레이드 # 15 피부를 절개.
- 그것을 건조하고 수술 현장에서 피부를 잡아 면봉 스왑으로 두개골을 폴란드어.
- Bregma의 봉합의 정점에서 시점에 유리 바늘의 팁을 사용하십시오. 여기 주입기 (좌표 "제로")의 초기 위치를 설정해야합니다.
- "X"와 두개골을 통해 stereotactic 장치의 "Y"축을 이동하여 몰락하는 지점을 설정합니다.
- 선택한 좌표에 매우 조심스럽게 구멍을 드릴. Microdrills 및 기타 금속 도구는 이전에 다음 ID 250에 소독을했다 ° 마른 유리 구슬 살균기와 함께 60 초 동안 C (콜 팔머, 고양이. 번호 EW - 10779-00).
- 좋은 포셉 조심스럽게 뼈의 가장 깊은 층을 제거하고 duramatter 막을 (당신이 밖으로 누출 일부 대뇌 척수를 볼 수 있습니다) 휴식과 함께.
- 그 바늘이 뚫고 구멍 갈 수 확인합니다.
- 당신은 parafilm의 작은 조각에 주사하고 데려가고 싶다는 약물의 피펫 1 μl.
- 두개골에 parafilm 놔.
- 당신은 액체가 유리 바늘로 올라간다는 것을 현미경으로 확인하면서, microinjector 휠을 회전하여 약물을 빨아.
- parafilm를 제거하고 제로 좌표를 다시 설정합니다.
- 유리 바늘 끝이 부드럽게 뇌의 표면을 만지 제로에서 "Z"좌표를 설정할 때까지 홀더 아래, 선택한 좌표에 바늘을 이동합니다.
- 선택 깊이에서 뇌 실질에 유리 바늘을 소개합니다.
- 천천히 ~ 1 NL / 초의 속도로 약물을 주사.
- 원하는 볼륨이 분사되면, 2 분 실질에 마약 확산하자. 그런 다음 부드럽게 천천히 바늘을 제거하는 진행합니다.
- 접착제는 수술 상처와 stereotactic 장치에서 동물을 제거하고 마취 복구를 위해 깨끗한 침대를 포함하는 미리 예열 케이지에 동물을 넣어.
- 이후 수술 진통제를 제공하기 위해 모든 동물은 24 H. 5 MG / kg 피하 Ketorolac 매 12 시간을 받았습니다
대표 결과 :
이 프로토콜을 따라하면, 매우 정확하게 주사는 취득과 매우 좁은 바늘 트랙 뇌 손상을 최소화합니다. 이 방법의 대표적인 결과로, 우리는 흰 물질의 책자 1-4 demyelination를 생산 코퍼스의 callosum에 lysophosphatidyl 콜린 (lysolecithin)을 주입했다. 유리 바늘에 의해 생산되는 뇌 손상을 최소화하기 위해, 우리는 코퍼스의 callosum에 lysolecithin의 20 NL을 주입, 200 NL만큼 필요한 경우에는 높은 볼륨이 동일한 방법으로 주입 수 있습니다. Demyelination은 흰색 물질 책자 (그림 2)에서 myelin 기본 단백질 표현의 부재에 의해 감지됩니다.
그림 1. 50 μm의 직경 유리 바늘. 이 짧은 거려 사이의 거리규모에 50 μm의 길이를 나타냅니다.
코퍼스의 callosum 그림 2. Lysolecithin 분사. Demyelination은 myelin 기본 단백질 표현 (점선 영역) 없음으로 표시됩니다. 유리 바늘 트랙트 (화살표)의 작은 크기를합니다. 바 = 100 μm의
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Discussion
방법은 두뇌에 매우 정확한 장소에 약물이나 바이러스 벡터의 대부분을 제공하는 매우 유용합니다이 비디오에서 보여주었다. 이 기술의 주요 장점 중 일부는 표적 지점, 주사의 정확성 및 뇌 병변 및 요로 손상 1, 2, 5, 6의 작은 크기의 신뢰성입니다. 일단 기술이 mistargeting의 범위 표준화되어 있어야 50 μm의 또는 2, 1 이하. 세포 이식은 또한 더 넓은, 100-150 μm의 7-9, 바늘을 사용하여 수행할 수 있습니다. 따라서 효율적인 세포 전달은 세포 이식에 의해 유도된 매우 구체적인 병변 최소화 피해로 입금하실 수 있습니다. 이 기법 세 중요한 단계가 있습니다 :
- 우리는 항상 드릴링 전에 선택한 좌표를 라벨에 인슐린 바늘로 부드럽게 머리를 긁적하는 것이 좋습니다.
- 빠르게 뇌의 표면을 침투하는 빠른 움직임으로 유리 바늘을 소개합니다.
- 최적의 깊이에 도달하면 마약이 자유롭게 두뇌에 확산하기 위해하자 "운하"를 만들기 위해 뇌 실질 조직에 깊이 바늘 0.1 mm를 소개합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
OG - P는 CONACyT S 그랜트 (CB - 2008-101476)과 FRABA (10분의 686)에 의해 지원되었다. AQ - H는 건강의 국립 연구소, 하워드 휴즈 의학 연구소의 로버트 우드 존슨 재단과 메릴랜드 줄기 세포 재단에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary glass tube | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| Micropipette puller | Kopf Instruments | Model 730 | |
| Microforge | World Precision Instruments, Inc. | Model 48000 | |
| Mineral oil | MSDS | M7700 | |
| High-vacuum grease | Dow Corning | 05054-AB | |
| Anesthesia: 2.5% Avertin | 2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v | ||
| Heater pad | Mastex | Model 900 | |
| Stereotactic device | Kopf Instruments | Model Kopf-900 | |
| Surgical scalpel blade # 15 | Medi-Cut | ||
| Micro driller | Ideal Micro Drill | 67-1000 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | ||
| 1-μL Micropipette | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | Vasiorkop with Contraves system | |
| Microinjector | Narishige International | Model MO-10 |
References
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