Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

Summary

Nous démontrons un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l'incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi.

Abstract

Isolement du cytoplasme axonal pur (axoplasme) de nerf périphérique est cruciale pour les études biochimiques de nombreux processus biologiques. Dans cet article, nous démontrons et décrire un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte sur la base des étapes suivantes: (1) la dissection des fascicules nerveux et la séparation des tissus conjonctifs; (2) incubation de courts segments de fascicules nerveux au milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale des structures, et (3) l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi. Caractérisation protéomique et biochimique de cette préparation a confirmé un haut degré d'enrichissement pour les composants axonale.

Protocol

Ce protocole permet l'isolement axoplasme avec minimisation de la contamination tissu glial et vasculaire. La méthode des rendements d'environ 70 à 100 mg de protéines totales par axoplasme une semaine de 80 à 10 Wistar vieux rat.

1. Disséquer nerfs sciatiques

1. Euthanasier deux rats par inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale. Confirmer la mort par la palpation de l'absence de battement avant la dissection début.
2. Nettoyer la zone de dissection avec 70% d'éthanol.
3. Coupez la peau, les muscles séparer et isoler nerf sciatique en utilisant des ciseaux et des pinces attentivement, sans endommager les vaisseaux sanguins. Disséquer les deux nerfs sciatiques (environ 1,5 cm chacune) de chaque animal et de collecter toutes les quatre nerfs dans un eppendorf de 500 pl de PBS 0,2 X + inhibiteurs, conservés sur la glace.
4. Transférer le culot de segments plats en plastique contenant au moins 2 mL de PBS inhibiteurs de protéase 0,2 x +.
5. Retirez l'épinèvre des nerfs à l'aide de pinces fines dans le champ binoculaire. Séparez les fascicules très soigneusement jusqu'à ce qu'ils deviennent troubles et commencent à flotter sur la surface de solution. Cette étape devrait être pratiqué jusqu'à ce qu'il puisse être effectué rapidement et avec précision (ne pas prendre plus de 10 minutes par nerf).

2. L'incubation, lavage et d'élution

1. Transfert séparés fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 500 ul de PBS contenant 0,2 x inhibiteurs de protéase pour une incubation de 2 h à température ambiante.
2. Laver au moins 3 fois avec 1 ml du même tampon en transférant les fascicules du tube Eppendorf à tube Eppendorf et agiter pendant 5 min après le transfert.
3. Pour enlever l'excès de liquide mis les fascicules dans un tube eppendorf de nouveaux vides et puis de transférer les fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 300 ul de PBS 1X contenant inhibiteur de protéase pour une incubation pendant 20-30 min à température ambiante.
4. Centrifuger 10 min à 10000 xg à 4 ° C.
5. Prenez le surnageant et mesurer la concentration de protéines. Ceci est votre préparation axoplasme.

3. Les résultats représentatifs

Figure 1. Axoplasme Western blot comparant isolé par la méthode manuelle serrer avec des échantillons isolés axoplasme comme indiqué dans ce protocole. Notez la réduction des niveaux d'albumine et de la GFAP, protéine du sang qui représente et les contaminations de cellules gliales, respectivement. En revanche, la tubuline axonale b3 est enrichi dans cette préparation, indiquant un niveau élevé de protéines axonales.

Discussion

Les analyses biochimiques et protéomiques ont confirmé que cette procédure réduit la contamination de cellules gliales sérum et ³ par rapport aux méthodes décrites précédemment pour l'isolement axoplasme de Squeeze mécanique ^1. Nous avons utilisé ce protocole d'isolement axoplasme à explorer dynéine basé signalisation rétrograde après lésion du nerf sciatique ^2, et s'attendre à ce qu'il ont une utilité dans l'exploration de nombreux autres processus dans le nerf périphérique adulte, y compris les interactions axone-glie ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).