Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

Summary

אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.

Abstract

בידוד של הציטופלסמה axonal טהור (axoplasm) מתוך עצב היקפי הוא קריטי עבור מחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנחנו מדגימים ולתאר פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגרים המבוססת על הצעדים הבאים: (1) דיסקציה של fascicles עצב והפרדה של רקמות החיבור, (2) הדגירה של קטעים קצרים של fascicles העצב בינוני hypotonic לשחרר את המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים; ו (3) מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים. אפיון proteomic וביוכימיות של הכנה זו אישרה רמה גבוהה של העשרת עבור רכיבים axonal.

Protocol

פרוטוקול זה מאפשר בידוד axoplasm עם צמצום של זיהום גליה רקמות וכלי דם. השיטה מניבה כ 70-100 axoplasm סך מיקרוגרם חלבון לכל one 8-10 חולדה הישנה שבוע Wistar.

1. לנתח עצבים sciatic

1. להרדים שני עכברושים משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם. אשר למוות על ידי מישוש מחוסר דופק לפני תחילת לנתיחה.
2. ספוגית באזור דיסקציה עם אתנול 70%.
3. חותכים את העור, השרירים להפריד ולבודד עצב השת באמצעות מספריים מלקחיים בזהירות מבלי לפגוע בכלי הדם. לנתח הן עצבים sciatic (כ 1.5 ס"מ כל אחת) מן החי כל לאסוף את כל ארבעת העצבים Eppendorf עם 500 μL PBS 0.2X + מעכבי, שמרה על הקרח.
4. מעבירים את פלחי החוצפה כלי פלסטיק המכילים לפחות 2 מ"ל PBS 0.2X מעכבי פרוטאז +.
5. הסר את epineurium מן העצבים באמצעות מלקחיים קנס כאמור היקף המשקפת. הפרד את fascicles בזהירות רבה עד שהם הופכים מעוננים מתחילים לצוף על פני השטח של פתרון. צעד זה צריך להיות מתורגל עד שהוא יכול להתבצע במהירות ובאופן מדויק (לא לוקח יותר מ 10 דקות לכל העצב).

2. , דגירה כביסה elution

1. העברת מופרדות fascicles לצינור Eppendorf טרי עם 500 μL של PBS 0.2X המכיל מעכבי פרוטאז עבור הדגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף לפחות 3 פעמים עם 1 מ"ל של אותו למאגר ידי העברת fascicles מהצינור Eppendorf אל צינור Eppendorf ורועדת במשך 5 דקות לאחר ההעברה.
3. כדי להסיר את עודפי הנוזלים לשים את fascicles לתוך צינור חדש Eppendorf ריק ולאחר מכן להעביר את fascicles לצינור Eppendorf חדש עם 300 μL של PBS 1X המכיל מעכבי פרוטאז עבור הדגירה 20-30 דקות ב RT.
4. צנטריפוגה 10 דקות ב XG 10,000 ב 4 ° C.
5. קח את supernatant וחלבון ריכוז למדוד. זוהי הכנה axoplasm שלך.

3. נציג תוצאות

באיור 1. Axoplasm המערבי כתם השוואת מבודדים בשיטה לסחוט ידנית עם דגימות axoplasm מבודד כמתואר בפרוטוקול זה. שים לב רמות נמוכות של אלבומין ו GFAP, המייצג חלבון בדם זיהומים תא גלייה, בהתאמה. לעומת זאת, טובולין B3 axonal מועשר לקראת זה, המעיד על רמה גבוהה של חלבונים axonal.

Discussion

מנתח ביוכימיים ו proteomic אישרו כי הליך זה מפחית את זיהום תא בסרום גליה ³ לעומת השיטות שתוארו בעבר על ידי בידוד axoplasm לסחוט מכני ^1. השתמשנו בפרוטוקול זה בידוד axoplasm לחקור dynein מבוססי איתות מדרדר לאחר פגיעה עצבית sciatic ^2, מצפה שיהיה השירות בחקר של תהליכים רבים אחרים העצבים ההיקפית מבוגר, לרבות האקסון, גליה אינטראקציות ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).