Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

Summary

Dimostriamo un protocollo per l'isolamento axoplasm da nervo sciatico ratto adulto sulla base di dissezione di fasci nervosi e l'incubazione in media ipotonica per liberare mielina e lisare non assonale strutture, seguita da estrazione del restante assone arricchito di materiale.

Abstract

Isolamento di puro citoplasma assonale (axoplasm) dal nervo periferico è di fondamentale importanza per gli studi biochimici di molti processi biologici. In questo articolo, dimostrare e descrivere un protocollo per l'isolamento axoplasm dal nervo sciatico ratto adulto basato sui seguenti passi: (1) dissezione dei fasci nervosi e la separazione del tessuto connettivo, (2) incubazione di brevi segmenti di fasci nervosi nel medio ipotonica a rilasciare mielina e lisare non assonale strutture; e (3) estrazione dei rimanenti assone arricchito materiale. Proteomica e caratterizzazione biochimica di questa preparazione ha confermato un alto grado di arricchimento per i componenti assonale.

Protocol

Questo protocollo permette di isolare axoplasm con minimizzazione di contaminazione di tessuti gliali e vascolari. Il metodo produce circa 70-100 proteina axoplasm totale mcg per uno 8-10 vecchio topo settimana Wistar.

1. Sezionare nervi sciatico

1. Euthanize due ratti da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale. Confermare la morte per la palpazione per mancanza di battito cardiaco prima di dissezione all'inizio.
2. Strofinare l'area dissezione con il 70% di etanolo.
3. Taglio, muscoli pelle separare e isolare nervo sciatico con le forbici e pinze con attenzione senza danneggiare i vasi sanguigni. Sezionare entrambi i nervi sciatico (circa 1,5 cm ciascuno) da ogni animale e raccogliere tutte e quattro nervi in ​​una eppendorf con 500 microlitri di PBS 0,2 X + inibitori, tenuta in ghiaccio.
4. Trasferire i segmenti coraggio di piatti di plastica contenente almeno 2 ml di PBS 0,2 X + inibitori della proteasi.
5. Rimuovere il epinevrio dai nervi con una pinza sottile nell'ambito di applicazione binoculare. Separare i fascicoli molto attentamente fino a che non diventa opaco e iniziare a galleggiare sulla superficie della soluzione. Questo passo dovrebbe essere praticato fino a quando non è possibile eseguire rapidamente e con precisione (non prendendo più di 10 minuti per nervo).

2. Incubazione, lavaggio e di eluizione

1. Trasferimento fascicoli separati in una nuova provetta eppendorf con 500 l di PBS 0,2 X che contiene inibitori della proteasi per l'incubazione per 2 ore a temperatura ambiente.
2. Lavare almeno 3 volte con 1 ml di buffer stesso, trasferendo i fasci di tubi eppendorf a tubo eppendorf e agitazione per 5 minuti dopo il trasferimento.
3. Per rimuovere l'eccesso di liquido messo i fasci in un nuovo tubo eppendorf vuota e poi trasferire i fascicoli in una nuova provetta eppendorf con 300 ml di PBS 1X contenente inibitore della proteasi per l'incubazione per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
4. Centrifugare 10 min a 10000 xga 4 ° C.
5. Prendete il surnatante e misurare la concentrazione di proteine. Questa è la tua preparazione axoplasm.

3. Rappresentante Risultati

Figura 1. Axoplasm Western Blot confronto isolato dal metodo di compressione manuale con campioni axoplasm isolati, come mostrato in questo protocollo. Noti la riduzione dei livelli di albumina e GFAP, in rappresentanza delle proteine ​​del sangue e contaminazioni di cellule gliali, rispettivamente. Al contrario, assonale tubulina b3 si arricchisce in questa preparazione, che indicano un alto livello di proteine ​​assonale.

Discussion

Analisi biochimiche e proteomiche hanno confermato che questa procedura riduce la contaminazione delle cellule gliali siero e ³ rispetto ai metodi precedentemente descritti per l'isolamento axoplasm dalla stretta meccanica ^1. Abbiamo usato questo protocollo axoplasm isolamento di esplorare dineina basato segnalazione retrograda dopo la lesione del nervo sciatico ^2, e si aspettano di avere utilità nell'esplorazione di molti altri processi in adulti nervi periferici, tra cui assone-glia interazioni ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).