Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Summary

Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.

Abstract

Isolamento do citoplasma axonal puro (axoplasma) de nervo periférico é fundamental para estudos bioquímicos de muitos processos biológicos. Neste artigo, vamos demonstrar e descrever um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base nas seguintes etapas: (1) dissecção dos fascículos do nervo e separação do tecido conjuntivo, (2) de incubação de pequenos segmentos de fascículos nervosos em meio hipotônico a liberação de mielina e lise não-axonal estruturas, e (3) extração do material axônio enriquecido restantes. Caracterização proteômica e bioquímica desta preparação confirmou um alto grau de enriquecimento para componentes axonal.

Protocol

Este protocolo permite o isolamento axoplasma com minimização de contaminação dos tecidos gliais e vasculares. O método rende aproximadamente 70-100 mg de proteína total por um axoplasma 10/08 ratos Wistar semanas de idade.

1. Dissecar nervo ciático

1. Euthanize dois ratos por inalação de CO ₂ seguido por deslocamento cervical. Confirmar a morte pela palpação por falta de batimentos cardíacos antes do início dissecção.
2. Swab a área de dissecção com etanol 70%.
3. Cortar a pele, músculos separar e isolar do nervo isquiático com tesoura e pinça com cuidado, sem danificar os vasos sanguíneos. Dissecar ambos os nervos ciático (cerca de 1,5 cm cada) de cada animal e recolher todos os quatro nervos em um eppendorf com 500 mL PBS 0,2 X + inibidores, conservados no gelo.
4. Transferir os segmentos nervosos para pratos de plástico contendo pelo menos 2 mL de PBS + 0,2 X inibidores da protease.
5. Remover o epineuro dos nervos usando uma pinça fina no âmbito binocular. Separar os fascículos com muito cuidado até que se tornem nublado e começar a flutuar na superfície da solução. Esta etapa deve ser praticado até que possa ser realizada com rapidez e precisão (não tendo mais de 10 min por nervo).

2. Lavar incubação, e eluição

1. Transferência de fascículos separados para um novo tubo Eppendorf com 500 mL de PBS contendo inibidores da protease de 0,2 para a incubação por 2 horas em temperatura ambiente.
2. Lavar pelo menos 3 vezes com 1 mL do mesmo tampão, transferindo os fascículos a partir de tubo eppendorf para tubo eppendorf e agitação por 5 min após a transferência.
3. Para remover o excesso de líquido colocar os fascículos em um tubo eppendorf novo vazio e depois transferir os fascículos para um tubo eppendorf novo com 300 mL de PBS 1X contendo inibidor da protease para a incubação por 20-30 min em temperatura ambiente.
4. Centrifugar 10 min a 10.000 xg, a 4 ° C.
5. Leve o sobrenadante e concentração de proteína medida. Esta é a sua preparação axoplasma.

3. Resultados representante

Figura 1. Ocidental axoplasma blot comparando isolados pelo método de aperto manual com amostras axoplasma isolado como mostrado neste protocolo. Observe a redução dos níveis de albumina e GFAP, representando proteína do sangue e contaminações de células gliais, respectivamente. Em contraste, axonal tubulina b3 é enriquecida nesta preparação, o que indica um alto nível de proteínas axonal.

Discussion

Análises bioquímicas e proteômica confirmaram que este procedimento reduz a contaminação de células gliais soro e ³ em relação aos métodos descritos anteriormente para o isolamento por axoplasma espremer mecânica ^1. Nós temos usado esse protocolo de isolamento axoplasma para explorar dineína baseado sinalização retrógrada após a lesão do nervo ciático ^2, e esperar que ela tenha utilidade na exploração de muitos outros processos no nervo periférico de adultos, incluindo axônio glia interações ^4.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).