Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

Summary

Dans cette vidéo, des techniques pour multicolor confocale imagerie time-lapse et l'ablation des cellules ciblées sont fournis. Time-lapse d'imagerie est utilisée pour surveiller le comportement de plusieurs types cellulaires d'intérêt

Abstract

Imagerie à haute résolution time-lapse de larves de poisson zèbre vivant peut être utilisé pour visualiser comment se déroulent les processus biologiques (pour revue, voir ^1). Poissons composés transgéniques qui expriment différents journalistes fluorescente dans des types cellulaires voisines de fournir un moyen de suivre les interactions cellulaires ² et / ou des tissus au niveau des réponses à des manipulations expérimentales au cours du temps. Dans cette vidéo, nous avons la démonstration de méthodes qui peuvent être utilisés pour l'imagerie de multiples types de cellules transgénique étiquetés en série dans chaque poisson sur les cours du temps qui peut durer de quelques minutes à plusieurs jours. Les techniques décrites sont applicables à toute étude cherchant à corréler le «comportement» des types de cellules voisines au cours du temps, y compris: «catch and release" 1) série de méthodes pour l'imagerie d'un grand nombre de poissons sur plusieurs jours successifs, 2) des approches simplifiées pour séparer fluorophores avec chevauchement d'excitation / émission des profils (par exemple, la GFP et YFP), 3) l'utilisation de lignées mutantes hypopigmentées d'étendre la fenêtre de temps disponible pour l'imagerie haute résolution en fin de stades larvaires de développement, 4) l'utilisation de la membrane cible fluorescente journalistes à révéler beaux détails morphologiques des cellules individuelles ainsi que des détails cellulaires dans les grandes populations de cellules, et 5) une méthode décrite précédemment pour l'ablation induite chimiquement de types de cellules transgénique ciblée, c'est-nitroreductase (NTR), la conversion médiatisée de substrats prodrogue, tels que le métronidazole (MTZ), aux dérivés cytotoxiques ^3,5.

Comme exemple de ces approches, nous allons visualiser l'ablation et la régénération d'un sous-type de la rétine bipolaires neurone au sein de chaque poisson sur plusieurs jours. Simultanément nous allons surveiller plusieurs autres types de cellules rétiniennes, y compris les voisins non-ciblés cellules bipolaires et le potentiel de dégénérescence stimulé les cellules souches rétiniennes (c.-à-glie Mϋller). Cette stratégie est appliquée dans notre laboratoire afin de caractériser les cellules et les tissus au niveau (par exemple, la niche de cellules souches) des réponses à la perte sélective et ciblée régénération des types de cellules neuronales.

Protocol

1. Lignées transgéniques et mutantes

1. Etablir / acquérir des lignes de poisson zèbre transgénique qui ont des types de cellule d'intérêt différemment étiquetés avec des variantes rapporteur fluorescent. Idéalement, le profil d'excitation / émission des journalistes sélectionnés devraient avoir un chevauchement minimal (par exemple, ECFP et EYFP), cependant ce n'est pas absolument nécessaire. Pour nos besoins, l'utilisation de membrane attachées aux journalistes fluorescents facilite grandement l'imagerie d'une amende de détails cellulaires, telles que les processus neuritique, à résoudre nombre de cellules individuelles et / ou des morphologies dans les grands groupes mêlés et à «mettre en évidence« les régions du contenu de membrane élevé, tels que neuropils synaptique.
2. Pour l'imagerie à la fin de stades larvaires, il est utile de tirer / cross lignées transgéniques en milieux mutant qui réduisent la pigmentation [par exemple, Roy Orbison (Roy) ou Roy Orbison; albinos (Roy; alb); ^4]. Dans notre expérience, la réduction des iridiphores (par exemple, Roy) est la question la plus critique, la mélanogenèse peut être adressée chimiquement en utilisant le 1-phényl 2-thiourée (PTU) ou avec "albinos" mutants qui manque mélanophores. Notez cependant que Ren et al. ^4, ont démontré des déficits visuels et de modestes changements morphologiques dans les rétines de poissons manquent melanaphores, et que la lumière intense peut induire la mort des photorécepteurs dans "albinos" mutants. Ainsi, ces questions doivent être prises en considération lors de la conception des expériences d'imagerie et / ou l'interprétation des données.
3. Pour cette démonstration, les lignes de poissons transgéniques et mutantes utilisées ont été:
   1. Tg (NYX: Gal4-VP16) ^{Q16A / +;} Tg (SAMU: GAP43-YFP) ^{Q16b / +;} Tg (SAMU-E1b: NfsB-mCherry) ^{C264 / +;} Tg (Pax6-DF4: GAP43-PCP) ^{Q01 / +;} Roy ^a9/a9
   3. Remarque: Dans le poisson "1", une sous-population de Nyx-promoteur défini rétine cellules bipolaires exprimer une membrane taggés YFP et / ou un journaliste NTR-mCherry fusion (la plus exprimer à la fois), et presque toutes les cellules rétiniennes exprimer une PCP membrane taggés . Poisson "2" sont comme ci-dessus, sauf les cellules gliales Müller expriment la GFP cytosolique et mondiaux d'expression PCP rétinienne a été éliminée. Expression de la fusion NTR-mCherry rend les cellules bipolaires NYX définis sensibles aux prodrogue induit l'ablation ^3,5.

2. Sélection et préparation des embryons / larves pour l'imagerie en direct

1. Maté transgéniques / lignées mutantes d'intérêt, de collecter les œufs et incuber / maintenir à 28,5 ° C dans une solution de 0.3X Danieau (ou «moyen d'embryons de choix).
2. Si ce n'est pas dans un "albinos" arrière-plan, PTU devrait être ajouté à inhiber l'activité de la tyrosinase avant toute preuve de la pigmentation dans le tissu d'intérêt (par exemple, ~ 16 HPF pour l'œil, 200 pM final). Notez que le traitement par PTU à des concentrations dépassant 75 uM peut provoquer une toxicité et / ou des effets tératogènes. Cependant, parce que l'œil est fortement pigmentés, les traitements en dessous de 200 uM sont pas adéquates pour l'imagerie haute résolution confocale; dans ces conditions, il est important de choisir des poissons sains à la recherche d'imagerie. Pour les tissus d'imagerie, 75 uM PTU peut être préférable. En outre, comme noté ci-dessus, l'utilisation de "albinos" lignées mutantes évite la nécessité de traiter avec des embryons PTU et est une stratégie privilégiée pour l'imagerie à la fin de stades larvaires.
3. Une fois que les reporters fluorescents sont évidents poissons de tri, selon l'expression du transgène et la santé générale en utilisant un microscope à fluorescence stéréo de zoom ou similaires.
4. Avant le premier jour de l'imagerie, dissoudre peu fondre agarose (LMA) en milieu d'embryon à une concentration finale de 0,5%, la chaleur et mélanger pour obtenir dans la solution, stocker à 40 ° C.
5. Le premier jour de l'imagerie, préparer la solution de montage: Ajouter tricaïne (un anesthésique, 756 uM final) et PTU (si nécessaire) à 0,5% en milieu LMA embryon, mélanger délicatement, et retour à 40 ° C.
6. Anesthetize poissons en transférant dans un milieu contenant l'embryon PTU et / ou tricaïne, laisser le temps aux poissons de devenir non-sensible au toucher (~ 3 min).
7. Transfert des poissons individuels en solution de montage, en prenant soin de ne pas diluer l'agarose afin qu'il puisse être réutilisé. Nous utilisons une micropipette avec embout parés pour le transfert, ce qui aide également à maintenir un volume contrôlé (~ 30 uL). Après l'acquisition, inverser la pipette et laisser le poisson se déposent au fond de sorte que le toucher de la pointe à la solution de montage permet le transfert de gravité, sans nécessité de dissiper tout liquide.
8. Après le transfert, l'expulsion d'une solution anesthésique micropipette et l'utiliser pour transférer les poissons dans un ~ 30 gouttes de solution de montage uL d'une boîte de Pétri.
   Note: Cette méthode de montage n'est pertinent que pour la microscopie debout, où travaillent de longue distance de l'eau d'immersion objectifs seront utilisés. Pour moi,thodes pertinents pour microscopes inversés, où des lamelles sont nécessaires, voir Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden et Sive, 2009.
9. Retour solution de montage à 40 ° C bloc de chauffage.
10. Utiliser une brosse à cils ou similaire tourner doucement le poisson dans l'orientation désirée et la position de la région d'intérêt dans le centre de la goutte d'agarose.
11. Répétez les étapes 6 à 10 à monter le nombre souhaité d'embryons par boîte. Pour série time-lapse expériences (voir ci-dessous), nous avons généralement monter six poissons à un moment et essayer de limiter les séances d'imagerie à 1 heure par groupe.
12. Alors que le montage d'autres poissons vérifier pour s'assurer sujets précédents maintenir l'orientation souhaitée jusqu'à agarose se solidifie (~ 3 min).
13. Après agarose solidifié, le transport du poisson à l'étape de microscope confocal et ajouter doucement moyennes embryon contenant PTU et / ou tricaïne à l'antenne jusqu'à ce que tous les poissons sont complètement submergés.

3. «Multicolore» dans l'imagerie confocale in vivo

Note: Nous avons essayé de généraliser le protocole ci-dessous telle qu'elle fournit des informations pertinentes pour les configurations de microscope autres. Des références spécifiques à l'Olympe et les applications logicielles ImageJ sont entre guillemets. Notre système d'imagerie est un Olympus FV1000 microscope droit confocal équipé de 405, 440, 488, 515, 559 et 635 nm lasers, deux variables canaux barrière filtre de détection (permettant les réglages d'onde d'émission pour être ajusté par incréments de 1 nm), une barrière standard filtre de canal (pour le rouge et le rouge lointain imagerie), et un canal de transmission de lumière.

1. Ouvrez le logiciel d'imagerie ("FV10-ASW») et l'utilisation des sources de lumière fluorescente soit transmis ou de localiser la région d'intérêt. Pour l'imagerie optimale de cellulaire et / ou moléculaire détaillée l'utilisation des objectifs à longue distance de travail de haute NA (par exemple, 60X, 1.2NA).
2. Si la collecte transmis des images en lumière, mise au point du diaphragme de champ pour l'éclairage de Kohler.
3. Choisissez fluorphores approprié dans la "Liste Dye" ou charger les paramètres d'acquisition d'un fichier image préalablement enregistrée. Faire des ajustements à fourchettes d'émissions ("Réglage spectrale») nécessaire à la séparation des signaux propres journaliste et / ou signal à bruit maximal. Ces paramètres doivent être définis de façon empirique pour chaque expérience afin de minimiser la diaphonie, mais de maximiser le signal; les paramètres pour les exemples fournis ici sont présentés ci-dessous:

   Flourphores	Lasers (nm)	Réglages Barrière / filtre d'émission (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) ** EGFP, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Imagerie des mCherry pourrait être améliorée en utilisant un laser de longueur d'onde plus élevée (par exemple, 568 ou 594 nm)
   ** Un mode d'imagerie séquentielle permettant dichroïque changements miroir et filtre barrière ("canaux virtuels") est nécessaire dû à l'émission / d'excitation chevauchement entre la GFP et YFP. GFP et mCherry peut être assigné à un canal, YFP à un canal distinct. Remarque: diaphonie entre la GFP et YFP images seront évidents avant soustraction d'image (Partie 6).
4. Assurez-vous que l'objectif utilisé est sélectionné dans le menu déroulant pour s'assurer que tous les logiciels préréglages définis sont correctement réglés.
5. Pour concentrer les lasers et les niveaux de puissance définie, sélectionner un look up table (LUT) qui révèle la saturation des pixels ("Salut-Lo") pour chaque canal. Réglez la sensibilité du détecteur («HV», la tension PMT) à une valeur compatible avec une qualité d'image désirée (définie empiriquement) et à augmenter progressivement l'intensité de sortie du laser jusqu'à l'image est acceptable éviter la saturation des pixels.
6. Vérifiez la diaphonie entre les canaux; en sorte que chaque ligne laser produit un signal détectable uniquement dans le canal approprié en tournant manuellement lasers sur et en dehors tout en surveillant tous les canaux d'imagerie. Pour éliminer la diaphonie de réduire la puissance du laser. Si aucune diaphonie est évident, tous les canaux peuvent être acquises en fournissant simultanément un gain de temps significatif.
7. Dans le cas de la diaphonie inévitable, utiliser un mode "séquentiel" imagerie qui commute entre les lasers / canaux individuellement. Les cas extrêmes (par exemple, l'imagerie GFP et YFP) nécessitent l'utilisation de modes séquentiels qui a également basculer miroirs dichroïques et / ou des filtres barrières ("canaux virtuels"). Remarque: cette option présente des retards importants dans le processus temporel d'acquisition d'image et ne peut être apappropriées pour la capture des processus hautement dynamiques.
8. "Zoom" et "Rotation" fonctions peuvent être utilisées pour autre châssis de la zone d'intérêt. Zoom peut également être utilisé pour améliorer la résolution de l'image, dans les limites du format objectives et de numérisation utilisé (par exemple, 512 x 512; pour plus d'informations sur ces questions, voir, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. Pour l'imagerie in vivo en général, et d'une importance particulière pour imagerie time-lapse, des techniques qui minimisent les problèmes phototoxicité (c'est à dire, l'accumulation de radicaux libres) ont besoin d'être souligné; des vitesses de balayage rapide (par exemple, 2 ms / pixel) et la sortie laser de faible niveaux (par exemple, 1%) doit être utilisé chaque fois que possible, ainsi que le format de balayage faible résolution suffisante pour capturer des informations saillantes.
10. Afin d'améliorer la résolution d'image, numérisation en moyenne ("Kalman") peut être utilisé lors de l'acquisition. Vitesses de balayage plus lent, mais aussi d'améliorer la résolution par laser augmentation de durée de séjour, qui ne fera qu'exacerber la phototoxicité et des questions de blanchiment. Notez que ces deux approches ne sont pas idéales pour time-lapse raison du risque de l'incapacité de saisir les changements rapides à travers une série Z, un phénomène que nous appelons «flou du temps". Notez que la moyenne par ligne par rapport par image peut aider à éliminer le «temps flou» des questions dans un seul plan mais pas dans z-profondeurs.
11. Si les intensités du signal est faible et la résolution d'image maximale n'est pas nécessaire (par exemple, il suffit de compter le nombre de cellules), augmentation de l'ouverture confocale (diamètre trou d'épingle) peuvent être utilisés pour augmenter le signal. Cela sert à garder l'intensité laser de faible, en réduisant la phototoxicité et de blanchiment, mais réglage de l'ouverture d'une valeur supérieure à 1 unité aéré conduit à des pertes rapides de la qualité d'image.
12. Définir z approfondie des dimensions en utilisant un mode de balayage rapide («Focus x4"). Parce que l'intensité du signal diminue généralement avec la profondeur z, il est préférable de commencer à z-stack acquisitions au plus bas de profondeur et se termine à la plus superficielle, ce qui permet des signaux plus difficile d'être acquis avant significatifs de blanchiment se produit.
13. Vérifiez pour la détection du signal est appropriée sur toute la profondeur de l'image. Si désiré, une fonction z dimension luminosité de correction ("Bright Z") peut être utilisé pour ajuster les paramètres d'acquisition d'image à des profondeurs spécifiées.
14. Régler la taille du pas z dimension selon les besoins expérimentaux. Par exemple, dans notre premier exemple (figure 1) nous avons été tout simplement prendre un «recensement des cellules dans la rétine individuels sur plusieurs jours successifs, donc nous avons mis le Z-profondeur de 15 microns et a pris cinq à sept images par la rétine. Cette stratégie nous a permis de goûter à chaque rétine sans chevauchement entre les images cellulaires. Dans notre deuxième exemple (figure 2), nous avons effectué rapidement 4D time-lapse films dans lesquels des signaux GFP et mCherry besoin d'être spatialement corrélées, ce qui nous avons mis la taille du pas de trois fois la résolution latérale théorique à un compromis qui a permis à z-stack images à prendre toutes les 5-10 minutes mais toujours servi à résoudre différents détails cellulaires.
15. Acquérir les images ("XYLZt") et enregistrez. Passez à la prochaine si les poissons d'effectuer une série time-lapse expérience (voir n ° 4 ci-dessous). Pour rapidement imagerie time-lapse voir # 5 ci-dessous.

4. Serial 'Catch and Release' imagerie: une méthode de suivi des changements cellulaires dans le poisson individuel sur jours successifs

1. Un «catch and release" protocole est utilisé pour minimiser la quantité de poissons de temps sont immobilisés et d'augmenter le nombre de poissons imagée par expérience. L'utilité de cette technique est limitée aux processus biologiques qui se déroulent sur ​​plusieurs jours (par exemple, les champagnes Mumm et al. 2006 ^2). Un avantage de cette approche est qu'elle permet des changements observés à être contrôlées en interne, c'est à dire, les comparaisons entre les différents états des individus plutôt que dans les populations. Par exemple, le suivi des changements dans le nombre de cellules marquées présentes dans un tissu donné peuvent être effectués avec précision, même si le nombre de cellules initialement étiquetés varie fortement entre chaque poisson. Méthodes d'utilisation de ce protocole dans le cadre d'un essai de prodrogue cellulaire induite par l'ablation ^3,5 sont fournies ici.
2. Pour visualiser l'ablation et la régénération de types de cellules ciblées dans les poissons au cours du temps, les images sont acquises confocale avant l'administration de prodrogue (pré-traitement), immédiatement après l'enlèvement prodrogue (post-traitement) et au cours de la période de récupération (Recovery images).
3. Pré-traitement d'imagerie: les poissons sont montés et imagé comme ci-dessus. Une fois que les poissons ont été imagées ils sont libérés dans le milieu de l'embryon (prodrogue +) et incubés à 28,5 ° C jusqu'à la session d'imagerie post-traitement. Travaillant en équipes de deux, un montage et libérant le poisson, l'imagerie est une bonne façon de maximiser le nombre de poissons qui peut être imagée par jour.
4. Après l'imagerie tous les poissons dans un plat unique remplacer le milieu contenant l'embryon tricaïne avec un milieu de l'embryon lui seul (+ / - PTU).
5. Pour libérer le poisson, l'utilisation de pinces pour couper à travers les bijoutiers agarose des deux côtés de la larve et puis doucement taquiner agarose écart jusqu'à ce que le poisson flotte librement dans le milieu de l'embryon.
6. Prodrug induite ablation: les larves de transfert dans un individu puits d'une plaque multipuits contenant du milieu d'embryon (+ / - PTU) + prodrogue (par exemple 10 mM métronidazole, MTZ). Pour assurer l'exactitude des concentrations prodrogue finale, nous avons généralement un volume défini aliquote de milieu d'embryon (+ / - PTU), contenant une concentration de 2X prodrogue (par exemple, 20 mM) dans chaque puits. Les poissons sont ensuite ajoutés aux puits dans un volume égal de milieu d'embryon (+ / - PTU) pour amener la concentration finale de prodrogue 1X.
7. Incuber à 28,5 ° C jusqu'à l'ablation des cellules ciblées peuvent être vérifiées.
   Remarque: traitements Prodrug nécessaires pour atteindre l'ablation réussie varie selon le type cellulaire ciblé, la concentration et la durée du traitement prodrogue devront être déterminées empiriquement, être conscient que des concentrations élevées provoquer une toxicité générale, par exemple,> 10 mm MTZ. En outre, la perdurance des signaux journaliste fragmenté peut compliquer l'évaluation du succès de l'ablation, dans certains cas, la microscopie confocale est nécessaire pour visualiser correctement la perte de cellules.
8. Post-traitement d'imagerie: les poissons sont montés de telle sorte que le tissu même orientés de façon optimale et imagé comme ci-dessus. Une fois que tous les poissons sur une plaque donnée ont été imagées ils sont libérés dans le milieu de l'embryon (+ / - PTU) dans des puits individuels (comme ci-dessus) et incubés à 28,5 ° C pour permettre la régénération du type de cellule ablation.
9. Selon l'âge des poissons et le temps requis pour la récupération, il peut être nécessaire pour nourrir les poissons pendant cette phase de l'essai. Nous utilisons la nourriture vivante comme les paramécies ou les rotifères pour assurer la survie optimale. Il est également conseillé de fournir les médias frais du jour, particulièrement si les poissons sont maintenus dans des volumes faibles (par exemple, des plaques 96 puits).
10. Récupération d'imagerie: Pour documenter la cinétique de remplacement cellulaire, le poisson peut être imagée sur une base quotidienne durant la période de récupération. Une fois la cinétique ont été établis le dosage peut être simplifiée par l'acquisition des images de récupération uniquement à des moments d'intérêt (par exemple, la récupération complète). La figure 1 donne un exemple de cette approche de nos études sur la régénération des cellules rétiniennes.
11. A l'issue de l'expérimentation du poisson devrait être euthanasié par immersion dans de 20X tricaïne (15,3 M) solution sur la glace.

5. Rapide imagerie time-lapse.

1. Pour rapidement imagerie time-lapse (c'est à dire, 'films') de fluorphores multiples, des techniques qui minimisent les problèmes phototoxicité sont critiques (voir ci-dessus). Comme indiqué précédemment, cette technique est mieux adaptée à fluorphores permettant simultanée, plutôt que séquentielle, de l'imagerie
2. Maintenir le poisson à 28,5 ° C en utilisant une platine chauffante, élément chauffant en verre ITO, ou similaire.
3. Utilisez des méthodes qui réduisent l'évaporation pour aider à stabiliser la température et l'osmolarité (par exemple, o-ring lamelles scellé pour microscopes inversés).
4. Si vous utilisez l'acquisition automatisée au cours des périodes prolongées veillez à définir la taille de pile pour permettre la croissance et / ou la dérive dans la dimension Z.
5. Réglez les intervalles de temps et de nombre de balayages («TimeScan" ou "TimeController"). Le taux d'acquisition devra être établie empiriquement en fonction de la dynamique du processus biologique imagée et / ou ajusté en fonction des propriétés de sensibilité phototoxique de la population cellulaire d'intérêt.
6. Acquérir les images ("XYLZt" bouton) et enregistrer.
7. Pour construire 'movies', des domaines d'intérêt devront être définis et alignés dans le x, y, z et les dimensions. Le processus complet est au-delà de la portée de cet examen du protocole, mais plusieurs logiciels sont disponibles qui facilitent également le zoom, rotation, et les fonctions panoramique lors de 4D image de l'assemblage (Volocity, Amira, etc.)

6. Traitement de l'image spectrale de séparation utilisant ImageJ Freeware

1. Idéalement, lors de la réalisation d'une expérience multi-reporter d'imagerie, il est préférable d'utiliser fluorphores qui sont bien séparées spectralement. Cependant, ce n'est pas toujours pratique et / ou possible. Ici nous fournissons une méthode simplifiée pour séparer fluorphores qui ont le chevauchement des profils d'excitation et d'émission, dans ce cas, la GFP et YFP. Dans l'exemple fourni, nous avons utilisé les techniques d'imagerie time-lapse décrit ci-dessus pour suivre le comportement de la GFP-étiquetée rétiniennes «cellules souches», glie Müller, lors de l'ablation ciblée et la régénération des cellules rétiniennes bipolaires étiqueté avec la YFP et NTR-mCherry (figure 2).
2. Collecter des images en utilisant les modes d'imagerie séquentielle et filtres barrières variables qui permettent aux fluorophores chevauchement être acquis indépendamment et partiellement séparés, respectivement (voir ci-dessus pour la GFP / YFP par exemple les paramètres). Pour supprimer la diaphonie, nous utilisons une image simple stratégie de soustraction qui enlève un signal de canaux d'un autre.
3. Soustraction d'image du processus: Install la dernière version d'ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Bio-Loci Formats outil (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , et d'aligner les piles de plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Utilisez le Loci Importer Bio-formats de plug-in pour ouvrir des fichiers d'image, il suffit de glisser le fichier d'intérêt sur la fenêtre ImageJ va démarrer l'outil d'importation. Fractionner les canaux en piles individuelles en utilisant les "canaux Split" case à cocher dans la fenêtre d'importation ou de les "canaux Split" onglet sous "Outils Channel" (Shift + Ctrl + Z) après le chargement.
5. Démarrez le Alignez 3 TP plugin (plugins> Aligner les piles> Aligner 3 TP). Les piles doivent être alignés pour assurer une bonne soustraction. Sélectionnez la pile de référence dans la première liste déroulante et la pile mal alignées dans la seconde. Cochez la case "utiliser xy origine relative» et «utilisation z relatifs origine» cases et cliquez sur "OK".
6. Pour démarrer le processus d'alignement, cliquez sur «Inscription tome" bouton. Une nouvelle fenêtre apparaît qui contient les paramètres d'alignement. Cette section a été optimisé par le distributeur du plugin, aucune modification n'est nécessaire, il suffit de cliquer sur "OK".
7. Lorsque vous avez terminé, une «alignés Stacks" fenêtre va apparaître. Sélectionnez "Sortie" de la fenêtre Aligner et la fenêtre de sortie devrait apparaître. Cette fenêtre est également optimisée et ne nécessite aucune modification. Cliquez sur "OK". Une nouvelle pile devrait apparaître dans l'espace de travail avec les «alignés» ajouté à la fin du titre du dossier.
8. Diaphonie seront supprimés en utilisant le «Calculateur d'image" (Processus d'image Calculatrice>). Sélectionnez la pile pour être soustraits dans la boîte déroulante et Image1 la pile utilisée dans la soustraction dans la boîte de Image2 déroulant. Sélectionnez "Soustraire" dans la boîte déroulante et cliquez sur l'Opération "OK". ImageJ va demander de processus de la pile, sélectionnez "Oui". Une nouvelle pile devrait apparaître, qui a enlevé la diaphonie entre les canaux se chevauchant.
9. Pour recréer la structure même image, avant Stacks l'alignement et la soustraction doivent être fusionnées. Sélectionnez «Chaînes Fusionner" dans Outils canal de la fenêtre. L'outil vous permettra de fusionner jusqu'à quatre piles dans un HyperStack.
   Remarque: Pour fusionner plus de 4 piles, les piles concaténer dans l'ordre désiré en utilisant l'outil concaténer (images> piles> outils> concaténer). Convertir la pile concaténée à un HyperStack (images pile> HyperStack> pour HyperStack). Concaténation des piles changements de la profondeur, le temps, le canal (ZCT) l'ordre, cela doit être réinitialisé dans le menu déroulant qui apparaît, réglez "afin de" xyztc, réglez "canaux", "tranches" et "cadres", selon le nombre de piles, de la profondeur de la pile, et le nombre de points dans le temps, respectivement ..
10. Enfin, tous les canaux doivent être colorisé, ajuster la luminosité et le contraste et sauvegardés comme des fichiers TIFF. De là, la conversion en RVB, le montage, z-projection, ou des séries chronologiques est le même processus que pour les fichiers originaux.

7. Les résultats représentatifs

Figure 1. Une série time-lapse d'images démontrant la perte ciblée confocale et la régénération des NTR-mCherry exprimer la rétine des cellules bipolaires (globules rouges). A & A ') Avant le traitement il ya l'expression mosaïque de membrane taggés journaliste YFP dans les cellules de "contrôle" bipolaire, en jaune, et la protéine de fusion nitroreductase-cerise au «ciblées» bipolaires apparaissent en rouge. B & B ') après traitement avec le métronidazole, le rouge nitroreductase cellules exprimant bipolaire, sont perdus, tandis que le jaune des cellules "contrôle" bipolaire, sont épargnés. Cela démontre la nature très spécifique de cette méthode d'ablation. ) C & C "Lorsque le métronidazole est enlevé, NTR-exprimer (rouge) le retour des cellules.

Figure 2. Fournit un exemple du processus de soustraction d'image qui permet la GFP et YFP à être proprement séparées suite à l'acquisition. A & A ') Avant de soustraction, de la GFP (green) et YFP (pseudocolored violet) les images sont alignées. B & B ') Le processus de soustraction permet YFP marqué cellules bipolaires à être retiré de l'image GFP, permettant GFP-étiquetée glie Müller pour être plus facilement détectées. C & C ") co-expression de la GFP (green) et mCherry (rouge) est évidente dans la cellule indiquée par la flèche. Parce que co-expression du marqueur de cellules gliales Müller et le marqueur de cellule bipolaire suggère que l'ablation des cellules gliales déclenche bipolaires Müller pour remplacer les cellules perdues. Cette interprétation est en accord avec les études récentes de la régénération rétinienne qui impliquent glie Müller comme «cellules souches» des blessures induites dans les deux mammifères et les poissons.

Discussion

Dans cette vidéo, un aperçu des techniques que nous utilisons pour multicolor confocale imagerie time-lapse et l'ablation des cellules ciblées sont fournies. Nous employons imagerie time-lapse de surveiller le comportement de plusieurs types cellulaires d'intérêt in vivo, tandis que l'ablation des cellules ciblées est utilisée pour étudier la fonction des circuits neuronaux et des cellules spécifiques paradigmes régénération neuronale. Les exemples présentés soulignent plusieurs avantages qui peuvent être tirées de ces approches. Peut-être plus significative, imagerie time-lapse fournit un paradigme au contrôle interne; phénomènes toute observés peuvent être reliés à des états antérieurs. Cela permet des comparaisons directes plutôt que de présumées être faite à travers des points de temps d'expérimentation, ce qui rend les changements relatifs facile à quantifier et à réduire expérimentale du «bruit» associé à des variations au sein d'une population. Un avantage de l'imagerie est multicolor la capacité de visualiser les changements dans l'interaction et / ou des types de cellules voisines. Par exemple, en utilisant une lignée transgénique dont les étiquettes glie Müller, nous sommes désormais caractériser la réponse de ces cellules souches potentielles blessures induites par la perte de discrets sous-populations de cellules rétiniennes. Nous avons également utilisé cette approche pour définir de nouveaux mécanismes de formation des circuits neuronaux ^2. Enfin, en plus d'études de la régénération cellulaire, nous avons récemment commencé à utiliser le système d'ablation NTR-basée pour enquêter sur le rôle fonctionnel des sous-types neuronaux donc discrète circuits neuronaux utilisant différents paradigmes comportementaux et les tests électrophysiologiques. L'avantage unique d'employer le poisson zèbre pour de telles études est que, en raison de leur capacité de régénération, les déficits induits sont temporaires. Ainsi, en corrélant avec les dosages d'imagerie time-lapse, nous pouvons caractériser les mécanismes qui conduisent à la réinnervation, ainsi que l'étendue de la réinnervation requis pour, la récupération fonctionnelle.

Les méthodes fournies peuvent être adaptés à de nombreuses questions différentes. Par exemple, des analyses similaires de l'ablation et la régénération peut être appliquée à n'importe quel sous-type transgénique définissables cellulaire. Collectivement, ces études ont le potentiel d'élargir notre compréhension de la régénération au niveau des types de cellules individuelles et discrètes au sein des niches de cellules souches.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).