Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

Summary

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés

Abstract

De alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de larvas de pez cebra de vida se puede utilizar para visualizar cómo se desarrollan los procesos biológicos (para revisión ver ^1). Pescado compuesto transgénicos que expresan diferentes reporteros fluorescentes en los tipos de células vecinas proporcionar un medio para seguir las interacciones celulares ² y / o respuestas a nivel de tejido de manipulaciones experimentales en el tiempo. En este vídeo, que muestran los métodos que se pueden utilizar para obtener imágenes de múltiples tipos de células en serie en la etiqueta transgénica pez sobre los cursos de tiempo que puede abarcar desde unos minutos hasta varios días. Las técnicas descritas son aplicables a cualquier estudio que busque relacionar el "comportamiento" de los tipos de células vecinas a través del tiempo, incluyendo: "catch and release" 1) serie de métodos para obtener imágenes de una gran cantidad de pescado en los días sucesivos, 2) métodos simplificados para la separación fluoróforos con la superposición de excitación / emisión perfiles (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y YFP), 3) el uso de hipopigmentadas líneas mutantes de extender la ventana de tiempo disponible para imágenes de alta resolución en las últimas etapas de larvas de desarrollo, 4) el uso de la membrana dirigido a los periodistas a revelar fluorescentes pequeños detalles morfológicos de las células individuales, así como los detalles celulares en poblaciones más grandes de las células, y 5) un método descrito anteriormente para químicamente inducida por la ablación de los tipos de células transgénicamente objetivo, es decir, nitrorreductasa (NTR) mediada la conversión de sustratos profármaco, como metronidazol (MTZ), a los derivados citotóxicos ^3,5.

Como ejemplo de estos enfoques, que se podrá visualizar la ablación y la regeneración de un subtipo de la retina neurona bipolar en cada pez durante varios días. Al mismo tiempo vamos a analizar varios otros tipos de células retinianas, incluyendo vecinos no atacaba las células bipolares y el potencial de estimular la degeneración de las células madre de la retina (es decir, las células de Mϋller). Esta estrategia está siendo aplicada en nuestro laboratorio para caracterizar las células y los tejidos a nivel (por ejemplo, el nicho de células madre) las respuestas a la pérdida selectiva y regeneración de los dirigidos tipos de células neuronales.

Protocol

1. Las líneas transgénicas y mutantes

1. Establecer y / o adquisición de líneas de pez cebra transgénico que tienen tipos de células de interés diferencial marcado con variantes reportero fluorescente. En condiciones óptimas, el perfil de excitación / emisión de los periodistas seleccionados deben tener una mínima superposición (por ejemplo, ECFP y EYFP), sin embargo esto no es absolutamente necesario. Para nuestros propósitos, el uso de la membrana atados a los periodistas fluorescentes facilita en gran medida de los finos detalles de imagen celular, tales como los procesos neuríticas, para resolver un número de celdas individuales y / o morfología de los grandes grupos comingled y "poner de relieve las regiones de la membrana de alto contenido, tales como neuropils sináptica.
2. Para la imagen en las últimas etapas larvales, es útil para obtener / cruzar las líneas de transgénicos en mutantes antecedentes que reducir la pigmentación [por ejemplo, Roy Orbison (Roy) o Roy Orbison; albino (Roy, alb), ^4]. En nuestra experiencia, la reducción de iridiphores (por ejemplo, Roy) es el tema más crítico, la melanogénesis se pueden abordar químicamente usando 1-fenil-2-tiourea (PTU) o con "albino" mutantes que carecen de melanóforos. Tenga en cuenta sin embargo que Ren et al. ^4, han demostrado déficits visuales y modestos cambios morfológicos en las retinas de los peces que carecen de melanaphores, y que la luz intensa puede inducir la muerte de los fotorreceptores en el "albino" mutantes. Por lo tanto, estas cuestiones deben tenerse en cuenta en el diseño de los experimentos de imagen y / o interpretación de los datos.
3. Para esta demostración, las líneas de peces transgénicos y mutantes fueron:
   1. Tg (Nyx: Gal4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (UAS: GAP43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{C264 / +;} Tg (PAX6-DF4: GAP43-PPC) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Nota: En el pescado "1", una subpoblación de nyx-promotor se define la retina las células bipolares expresar una membrana-YFP etiquetados y / o un periodista-NTR mCherry fusión (la mayoría de expresar tanto), y casi todas las células de la retina expresan una membrana PPC-etiquetados . Pescado "2" son como antes, excepto las células de la glia Müller expresar GFP citosólica y la expresión global de la retina PPC ha sido eliminada. Expresión de la fusión NTR-mCherry hace nyx definidos por las células bipolares susceptibles a profármaco inducida por la ablación ^3,5.

2. Selección y Preparación de embriones / larvas de imágenes en vivo

1. Compañero de transgénicos / líneas mutantes de interés, recoger los huevos y se incuban / mantener a 28,5 ° C en una solución de 0.3x Danieau (o "medio embrión" de la elección).
2. Si no está en un "albino" de fondo, PTU, debe añadirse a inhibir la actividad de la tirosinasa antes de cualquier prueba de la pigmentación en el tejido de interés (por ejemplo, a 16 HPF para el ojo, 200 mM final). Tenga en cuenta que el tratamiento con PTU a concentraciones superiores a 75 M puede causar toxicidad y / o efectos teratogénicos. Sin embargo, debido a que el ojo es muy pigmentada, los tratamientos por debajo de 200 M no son adecuadas para imágenes de alta resolución confocal, en estas condiciones es importante para seleccionar peces sanos en busca de imágenes. Para tejidos de imágenes, el 75 M PTU puede ser preferible. Además, como se señaló anteriormente, el uso de "albino" líneas mutantes obvia la necesidad de tratar a los embriones con PTU y es una estrategia preferida para la imagen en las últimas etapas larvales.
3. Una vez que los periodistas son los peces fluorescentes evidente, más o menos de acuerdo con la expresión del transgén y la salud general utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo de captura o algo similar.
4. Antes de la primera jornada de la imagen, se disuelven bajo agarosa fundido (LMA) en medio de embrión a una concentración final de 0,5%, el calor y la mezcla para obtener en la solución, almacenar a 40 ° C.
5. En el primer día de la imagen, preparar la solución de montaje: Añadir tricaína (un anestésico, 756 mM final) y PTU (si es necesario) a un 0,5% en el medio LMA embrión, mezclar suavemente y volver a 40 ° C.
6. Anestesiar a los peces mediante la transferencia de embriones en un medio que contiene PTU y / o tricaína, dar tiempo para que los peces se convierten en no-sensible al tacto (~ 3 min).
7. Ponga el pescado en una solución de montaje individuales, teniendo cuidado de no diluir la agarosa para que pueda ser reutilizado. Utilizamos una micropipeta con punta recortada para transferir, lo que también ayuda a mantener un volumen controlado (~ 30 l). Después de adquirir, invertir pipeta y dejar que los peces depositan en el fondo de manera que tocar la punta de la solución de montaje permite la transferencia de la gravedad sin necesidad de disipar cualquier líquido.
8. Después de la transferencia, expulsar solución anestésica de micropipeta y lo utilizan para la transferencia de los peces en un ~ 30 gotas L de solución de montaje de una placa de Petri.
   Nota: Este método de montaje sólo es relevante para la microscopía de pie en el largo distancia de trabajo de los objetivos de inmersión en agua se utilizará. Para míthods relevantes para microscopios invertidos, donde cubreobjetos se requieren, consulte Andersen et al, 2010;. O'Brien et al, 2009;. Graeden y SIVE, 2009.
9. Volver a la solución de montaje de 40 ° C bloque de calentamiento.
10. El uso de un cepillo de pestañas o similar gire suavemente el pescado en la orientación deseada y la posición de la región de interés en el centro de la gota de agarosa.
11. Repita los pasos 6 a 10 para montar el número deseado de embriones por placa. Para serial time-lapse experimentos (ver más abajo) que normalmente montar seis peces a la vez y tratar de limitar las sesiones de imagen a 1 hora por grupo.
12. Mientras que los peces de montaje de otros revise para asegurarse de que los sujetos anteriores mantener la orientación deseada hasta que se solidifica de agarosa (~ 3 min).
13. Después de agarosa se ha solidificado, el transporte de pescado a la platina del microscopio confocal y suavemente se añade medio de embrión que contiene PTU y / o tricaína al plato hasta que todos los peces están completamente sumergidos.

3. "Multicolor" in vivo microscopía confocal

Nota: Hemos tratado de generalizar el protocolo por debajo de tal manera que proporciona información relevante para las configuraciones de otro microscopio. Referencias específicas a Olimpo y aplicaciones de software ImageJ están entre comillas. Nuestro sistema de imagen es una Olympus FV1000 microscopio confocal vertical equipado con 405, 440, 488, 515, 559 y 635 nm láser, dos canales de variable de filtro de detección de la barrera (que permite la configuración de onda de emisión que se ajustan en incrementos de 1 nm), una barrera estándar filtro de canal (por roja y roja lejana imagen), y un canal de transmisión de luz.

1. Abra el software de imágenes ("FV10-ASW") y el uso que se remitieron o fuentes de luz fluorescente para localizar la región de interés. Para obtener imágenes de óptima del celular y / o molecular uso detalle de larga distancia con los objetivos de trabajo de alto NA (por ejemplo, 60X, 1.2NA).
2. Si la recogida transmite las imágenes de luz, el enfoque del diafragma de campo para la iluminación de Kohler.
3. Elija fluorphores apropiado de la "Lista de tinte" o cargar los parámetros de adquisición de un archivo de imagen guardado previamente. Realizar ajustes en los rangos de emisiones ("Configuración espectral") necesaria para la separación limpia de las señales de periodista y / o la señal de máximo a las relaciones de ruido. Estos ajustes tendrán que ser definidos empíricamente para cada experimento para minimizar la diafonía, sino maximizar la señal, la configuración de los ejemplos que aquí se muestran a continuación:

   Flourphores	Láseres (nm)	Configuración de barrera / Emisión de filtro (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) ** EGFP, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Imágenes de mCherry podría mejorarse utilizando un láser de longitud de onda mayor (por ejemplo, 568 o 594 nm)
   ** A modo de imágenes secuenciales que permite cambios espejo dicroico y filtro de barrera ("canales virtuales") es necesario debido a la superposición de emisión / excitación entre las buenas prácticas agrarias y YFP. GFP y mCherry se pueden asignar a un canal, YFP a un canal separado. Nota: la interferencia entre las buenas prácticas agrarias y YFP imágenes serán evidentes antes de la sustracción de la imagen (Parte 6).
4. Asegúrese de que el objetivo que se utiliza es seleccionado en el menú desplegable para asegurarse de que cualquier software de presets definidos se ajustan correctamente.
5. Para enfocar el láser y los niveles establecidos de energía, seleccione una tabla de búsqueda (LUT) que pone de manifiesto la saturación de píxeles ("Hi-Lo") para cada canal. Detector de ajustar la sensibilidad ("AT", voltaje PMT) a un valor coherente con calidad de imagen deseada (que se define empíricamente) y elevar progresivamente la potencia del láser hasta que la intensidad de la imagen es aceptable evitar la saturación de píxeles.
6. Compruebe si hay interferencias entre canales, asegurarse de que cada línea láser produce la señal detectable solamente en el canal adecuado girando manualmente láser dentro y fuera de control, mientras que todos los canales de imagen. Para eliminar la diafonía reducir la potencia del láser. Si no hay interferencia es evidente, todos los canales se pueden adquirir al mismo tiempo proporcionar un ahorro significativo de tiempo.
7. En el caso de la interferencia es inevitable, utilice un "secuencial" modo de imagen que permite cambiar entre los láseres / canales individualmente. Casos extremos (por ejemplo, imágenes de las buenas prácticas agrarias y YFP) requieren el uso de modos secuenciales que también cambian espejos dicroicos y / o filtros de barrera ("canales virtuales"). Nota: esta opción presenta significativos retrasos temporales en el proceso de adquisición de la imagen y no puede ser apapropiado para la captura de procesos muy dinámicos.
8. "Zoom" y las funciones de "rotación" se puede utilizar para enmarcar aún más el área de interés. El zoom también se puede utilizar para mejorar la resolución de la imagen, hasta los límites de la forma de objetivos y análisis utilizados (por ejemplo, 512 x 512, para obtener información sobre estos temas, ver, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. De imágenes in vivo, en general, y de especial importancia para la imagen de lapso de tiempo, las técnicas que minimicen los problemas de fototoxicidad (es decir, la acumulación de radicales libres) es necesario enfatizar, rápidas velocidades de escaneo (por ejemplo, 2 ms / pixel) y la salida del láser de baja niveles (por ejemplo, 1%) se debe utilizar siempre que sea posible, así como la más baja resolución de escaneado de formato adecuado para la captura de información relevante.
10. Para mejorar la resolución de la imagen, escanear un promedio ("Kalman") se puede utilizar durante la adquisición. Velocidades más lentas también mejorar la resolución de escaneo láser, pero aumentar el tiempo de permanencia, lo que agravará la fototoxicidad y las cuestiones de blanqueo. Tenga en cuenta que estos dos enfoques no son ideales para time-lapse debido al potencial de la incapacidad para captar los cambios rápidos a través de un z-series, un fenómeno que llamamos "desenfoque tiempo". Tenga en cuenta que en promedio por línea de frente a marco puede ayudar a eliminar el "tiempo borroso" temas dentro de un solo plano, pero no a través de z-profundidad.
11. Si la intensidad de señal es bajo y la resolución de imagen máxima no es necesario (por ejemplo, simplemente contando el número de células), el aumento de la apertura confocal (diámetro del agujero de alfiler) se puede utilizar para aumentar la señal. Esto sirve para mantener la intensidad de láser de baja, la reducción de fototoxicidad y blanqueo, sin embargo el ajuste de la abertura a un valor mayor que 1 unidad de aireado conduce a pérdidas rápidas en calidad de imagen.
12. Definir z profundidad las dimensiones usando un modo de exploración rápida ("Focus x4"). Debido a la intensidad de la señal por lo general disminuye con la profundidad z lo mejor es empezar a z-stack adquisiciones en lo más profundo y terminan en la más superficial, esto permite que las señales más difícil de ser adquirido antes del blanqueamiento se produce significativos.
13. Compruebe si hay detección de la señal adecuada en toda la profundidad de la imagen. Si lo desea, una función de brillo de la dimensión z corrección ("Bright Z") se puede utilizar para ajustar los parámetros de adquisición de imágenes a una profundidad especificada.
14. Establecer el tamaño del paso z-dimensión de acuerdo a las necesidades experimentales. Por ejemplo, en nuestro primer ejemplo (Figura 1) simplemente estábamos tomando un "censo de células en la retina individuales en días sucesivos, con lo que nos fijamos el z-profundidad de 15 micrones y se llevó seis y cincuenta y cinco imágenes por la retina. Esta estrategia nos permitió tomar muestras de cada retina sin superposición celular entre las imágenes. En el segundo ejemplo (Figura 2), se realizó un rápido time-lapse 4D películas en las que las señales de las buenas prácticas agrarias y mCherry necesarios para ser espacialmente correlacionadas, por lo que establecer el tamaño del paso a tres veces la resolución teórica lateral a un acuerdo que permitió z-stack imágenes a tomar cada 5-10 minutos, pero aún sirven para resolver los detalles celulares individuales.
15. Adquirir imágenes ("XYLZt") y guardar. Pasar a la siguiente pez si la realización de una serie de lapso de tiempo del ensayo (véase # 4). Para un rápido time-lapse de imágenes ver # 5.

4. "Captura y liberación 'de serie de imágenes: un método para el seguimiento de los cambios celulares en cada pez en días sucesivos

1. A 'captura y liberación' se utiliza el protocolo para reducir al mínimo la cantidad de pescado vez se inmovilizan y aumentar el número de peces imágenes por experimento. La utilidad de esta técnica se limita a los procesos biológicos que se desarrollan durante los días (por ejemplo, Mumm et al. 2006 ^2). Una de las ventajas de este enfoque es que permite que los cambios observados a ser controlado internamente, es decir, las comparaciones entre los diferentes estados de los individuos más que entre las poblaciones. Por ejemplo, el seguimiento de los cambios en el número de células marcadas presentes en un determinado tejido se puede realizar con precisión, incluso si el número de células inicialmente etiquetados varía mucho entre los peces. Métodos para utilizar este protocolo en el contexto de un ensayo de células inducida por la ablación profármaco ^3,5 se proporcionan aquí.
2. Para visualizar la ablación y la regeneración de los tipos de células específicas en cada pez a través del tiempo, imágenes de confocal se adquieren antes de la administración profármaco (Pre-tratamiento), inmediatamente después de sacarlas profármaco (post-tratamiento) y durante el período de recuperación (las imágenes de recuperación).
3. Pre-tratamiento de imágenes: Los peces son montados y la imagen de arriba. Una vez que los peces han sido fotografiados son liberados al medio de embriones (profármaco +) y se incubaron a 28,5 ° C hasta que la sesión de imágenes post-tratamiento. Trabajo en equipos de dos, una de montaje y la liberación de los peces, el diagnóstico por imágenes es una buena manera de maximizar el número de peces que se pueden obtener imágenes por día.
4. Después de la filmación todos los peces en un solo plato reemplazar el medio embrión que contiene tricaína con medio solo embrión (+ / - PTU).
5. Para liberar los peces, el uso de fórceps joyeros para cortar a través de agarosa en ambos lados de las larvas y luego suavemente se burlan de agarosa de distancia hasta que el pescado flota libremente en el medio de embrión.
6. Profármaco inducida por la ablación: larvas de transferencia en un individuo de una placa de pocillos múltiples, que contienen medio de embriones (+ / - PTU) + profármaco (por ejemplo, 10 mM metronidazol, MTZ). Para garantizar la exactitud de las concentraciones de profármaco final que normalmente alícuota de un volumen de medio de embriones (+ / - PTU) que contiene una concentración 2X de profármaco (por ejemplo, 20 mM) en cada pocillo. Pescado se añaden a los pocillos en un volumen igual de medio de embriones (+ / - PTU) para reducir la concentración profármaco final a 1X.
7. Se incuba a 28.5 ° C hasta que la ablación dirigida de células puede ser verificada.
   Nota: Los regímenes de tratamiento profármaco necesarios para lograr con éxito la ablación varían de acuerdo con el tipo de célula específica, la concentración de profármaco y la duración del tratamiento tendrá que ser determinada empíricamente, tenga en cuenta que las altas concentraciones causan toxicidad general, por ejemplo,> 10 mm MTZ. Además, la pervivencia de las señales de reportero fragmentada puede complicar la evaluación del éxito de la ablación, en algunos casos se requiere de microscopía confocal para visualizar adecuadamente la pérdida de células.
8. Post-tratamiento de imágenes: El pescado es montado de manera que el tejido mismo de forma óptima orientación y la imagen de arriba. Una vez que todo el pescado en un plato dado han sido fotografiados son liberados al medio embrión (+ / - PTU) en los pozos individuales (como antes) y se incubaron a 28,5 ° C para permitir la regeneración del tipo de células ablación.
9. Dependiendo de la edad de los peces y el tiempo necesario para la recuperación puede ser necesario para alimentar a los peces durante esta etapa de la prueba. Utilizamos alimentos vivos tales como los paramecios o rotíferos para asegurar la supervivencia óptima. También es aconsejable proporcionar los medios de comunicación fresca a diario, sobre todo si los peces se mantienen en un volumen bajo (por ejemplo, placas de 96 pocillos).
10. La recuperación de imágenes: Para documentar la cinética de la sustitución de células, los peces pueden ser reflejados en una base diaria durante el período de recuperación. Una vez que la cinética se ha establecido el ensayo se puede simplificar mediante la adquisición de imágenes de recuperación sólo en momentos de interés (por ejemplo, recuperación, completa). La Figura 1 muestra un ejemplo de este enfoque de nuestros estudios de regeneración de las células retinianas.
11. A la conclusión de los peces experimento debe ser sacrificado por inmersión en 20X tricaína (15,3 M) solución en el hielo.

5. Rápido time-lapse de imágenes.

1. Para un rápido time-lapse de imágenes (es decir, "películas") de fluorphores múltiples técnicas que minimicen los problemas de fototoxicidad son críticos (ver arriba). Como se señaló anteriormente, esta técnica se adapta mejor a fluorphores permitiendo simultáneamente, en lugar de secuencial, las imágenes
2. Mantener los peces a 28,5 ° C utilizando una etapa de calefacción, ITO elemento de calefacción de vidrio o similar.
3. Utilizar métodos que reducen la evaporación para ayudar a estabilizar la temperatura y la osmolaridad (por ejemplo, o-ring sellado cubreobjetos para microscopios invertidos).
4. Si se utiliza la adquisición automatizada por períodos prolongados, asegúrese de ajustar el tamaño de la pila para permitir el crecimiento y / o la deriva en la dimensión z.
5. Establecer los intervalos de tiempo y número de análisis ("TimeScan" o "TimeController"). Las tasas de adquisición deberá ser establecida empíricamente de acuerdo a la dinámica de los procesos biológicos imágenes y / o ajustado según la sensibilidad de las propiedades fototóxicas de la población celular de interés.
6. Adquirir imágenes ("XYLZt" botón) y guardar.
7. Para la construcción de "películas", áreas de interés tendrán que ser definidos y alineados en la x, y, z y las dimensiones. El proceso completo está fuera del alcance de esta revisión del protocolo, pero varios programas de software están disponibles, que también facilitan el zoom, rotación, y las funciones panning en la imagen 4D de montaje (Volocity, Amira, etc.)

6. Separación espectral de procesamiento de imágenes con ImageJ Freeware

1. En condiciones óptimas, al realizar un experimento multi-reportero de imagen es mejor utilizar fluorphores que están bien separadas espectralmente. Sin embargo, esto no siempre es práctico y / o posible. Aquí le ofrecemos un método simplificado para la separación de fluorphores que se superponen los perfiles de excitación y emisión, en este caso las buenas prácticas agrarias y YFP. En el ejemplo citado, se han utilizado las técnicas de imagen lapso de tiempo descrito anteriormente para el seguimiento del comportamiento de las buenas prácticas agrarias-como 'células madre' la retina, las células de Müller, durante la ablación específica y la regeneración de las células de la retina bipolar etiquetados con YFP y NTR mCherry- (Figura 2).
2. Recoger las imágenes con modos secuenciales de imágenes y filtros variables barrera que permiten fluoróforos superposición a ser adquiridos de forma independiente y separado parcialmente, respectivamente (ver más arriba de la GFP / YFP ejemplo de configuración). Para eliminar la interferencia que usamos una imagen simple estrategia de sustracción que quita una señal de los canales de la otra.
3. Resta la imagen del proceso: Install la última versión de ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Bio-Formatos de herramientas (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) y alinear las pilas en el complemento (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Utilice el Loci Bio-Formatos de importación plug-in para abrir archivos de imagen, simplemente arrastrando el archivo de interés en la ventana de ImageJ se iniciará la herramienta de importación. Dividir los canales en pilas individuales con los "Canales Split" casilla de verificación en la ventana de importación o en la pestaña "Canales de división" en "Herramientas de canales" (shift + ctrl + z) después de la carga.
5. Iniciar el TP 3 Alinee plugin (plugins> Alinear las pilas> Alinear 3 TP). Las pilas deben ser alineados para garantizar la adecuada resta. Seleccione la pila de referencia en el primer cuadro desplegable y la pila de mal alineados en el segundo. Marque la casilla "uso origen xy relativa" y "uso de z con respecto origen" cajas y haga clic en "Aceptar".
6. Para iniciar el proceso de alineación, haga clic en el "Registro de Volumen" botón. Una nueva ventana aparecerá que contiene los parámetros de alineación. Esta sección ha sido optimizado por el distribuidor del plug-in, no es necesario realizar modificaciones, haga clic en "Aceptar".
7. Cuando haya terminado, un "Alineados pilas" aparecerá la ventana. Seleccione "salida" de la ventana de alineación y la ventana de resultados debería aparecer. Esta ventana también se ha optimizado y no necesita ninguna modificación. Haga clic en "Aceptar". Una pila nueva debe aparecer en el espacio de trabajo con "Alineados", añade al final del título del archivo.
8. Diafonía se puede eliminar mediante el "Calculador de Imagen" (Proceso> Calculadora de la imagen). Seleccione la pila que se restará en el cuadro desplegable Image1 y la pila utilizada en la resta en el cuadro desplegable Image2. Seleccione "restar" en el cuadro desplegable y haga clic en la operación "OK". ImageJ le pedirá que el proceso de la pila, seleccione "Sí". Una pila nueva debe aparecer lo que ha eliminado la interferencia entre canales se solapan.
9. Para volver a crear la estructura misma imagen antes de las pilas de alineación y la resta deben ser combinadas. Seleccione "Canales de fusión" en la ventana del canal de herramientas. La herramienta le permite combinar hasta cuatro pilas en un HyperStack.
   Nota: Para combinar más de 4 pilas, pilas de concatenar en el orden deseado usando la herramienta de concatenar (imágenes> pilas> Herramientas> concatenar). Convertir la pila concatenado a una HyperStack (imágenes pila> HyperStack> para HyperStack). Concatenación de las pilas de los cambios de la profundidad, tiempo, orden de los canales (ZCT), este debe ser reiniciado en el menú desplegable que aparece, establecer el "orden" a xyztc, establecer "canales", "cortes" y "cuadros" de acuerdo con la número de pilas, la profundidad de la pila, y el número de puntos de tiempo, respectivamente ..
10. Finalmente, todos los canales deben ser coloreada, ajustado por el brillo y el contraste, y se guardan como archivos TIFF. A partir de aquí, la conversión a RGB, montaje, z de proyección, o de series de tiempo es el mismo proceso que para los archivos originales.

7. Resultados representante

Figura 1. Una serie de lapso de tiempo de imágenes confocal demuestra la pérdida específica y la regeneración de NTR-mCherry expresar la retina las células bipolares (glóbulos rojos). A & A ') Antes del tratamiento es la expresión del mosaico de la membrana de etiquetado YFP reportero de "control" células bipolares, que se muestra en amarillo, y nitrorreductasa-Cherry proteína de fusión en "blanco" bipolares muestran en rojo. ) Después del tratamiento B & B 'con el metronidazol, el rojo nitrorreductasa que expresan las células bipolares, se pierden, mientras que el amarillo "control" células bipolares, están a salvo. Esto demuestra el carácter altamente específico de esta metodología de la ablación. ) C & C 'Cuando el metronidazol se elimina, NTR que expresan (rojo), las células de retorno.

Figura 2. Proporciona un ejemplo del proceso de sustracción de imágenes que permite a las buenas prácticas agrarias y YFP ser claramente separadas después de la adquisición. A & A) Antes de la sustracción, la GFP (verde) y YFP (pseudocolored morado) las imágenes se alinean. B & B ') El proceso de sustracción permite YFP marcado con las células bipolares para ser removido de la imagen de la GFP, permitiendo a las buenas prácticas agrarias marcado con las células de Müller a ser más fácil de detectar. C & C ") Co-expresión de la GFP (verde) y mCherry (rojo) es evidente en la celda indicada por la flecha. Debido a que co-expresión del marcador de células glia Müller y el marcador de célula bipolar sugiere que la ablación de células bipolares activa las células de Müller para reemplazar las células perdidas. Esta interpretación está en consonancia con los últimos estudios de la regeneración de la retina que implican a las células de Müller como "células madre" inducidas por lesiones, tanto en mamíferos y peces.

Discussion

En este vídeo, un resumen de las técnicas que utilizamos para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporciona. Contamos con time-lapse de imágenes para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés en vivo, mientras que la ablación dirigida celda se utiliza para estudiar la función de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas de regeneración neuronal. Los ejemplos que se muestran destacan varias ventajas que se puede extraer de estos enfoques. Quizá lo más importante, time-lapse de imágenes proporciona un paradigma controlado internamente, fenómenos todos y cada uno observado puede relacionarse con estados previos. Esto permite que las comparaciones directas en lugar de inferir que se hizo a través de los puntos de tiempo experimental, por lo que los cambios relativos más fáciles de cuantificar y reducir experimental "ruido" asociado a las variaciones dentro de una población. Una ventaja de la imagen multicolor es la capacidad de visualizar los cambios en la interacción y / o tipos de células vecinas. Por ejemplo, utilizando una línea transgénica que las etiquetas de las células de Müller, que ahora caracterizan la respuesta de estas células madre potencial de lesión inducida por la pérdida de la discreta subpoblaciones de células retinianas. También hemos utilizado este enfoque para definir nuevos mecanismos de formación de circuitos neurales ^2. Finalmente, además de los estudios de regeneración celular, recientemente hemos comenzado a utilizar el sistema de ablación por NTR basada en investigar el papel funcional de los subtipos neuronales tanto los circuitos neuronales discretos utilizando diversos paradigmas de comportamiento y ensayos electrofisiológicos. La única ventaja de emplear al pez cebra para tales estudios es que, debido a su capacidad de regeneración, los déficits inducidos son temporales. De este modo, mediante la correlación con los ensayos de imágenes con lapso de tiempo se pueden tipificar los mecanismos que conducen a la reinervación, así como la extensión de la reinervación necesarios para la recuperación funcional.

Los métodos siempre se puede adaptar a muchas preguntas diferentes. Por ejemplo, los análisis similar de la ablación y la regeneración se puede aplicar a cualquier subtipo celular transgénica definible. En conjunto, estos estudios tienen el potencial para ampliar nuestra comprensión de la regeneración en el nivel de tipos de células individuales y en discreta nichos de células madre.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).