Summary
inducible lysine decarboxylase की गतिविधि सब्सट्रेट एल lysine और उत्पाद cadaverine 2,4,6-trinitrobenzensulfonic एसिड के साथ प्रतिक्रिया adducts कि टोल्यूनि में अंतर विलेयता फार्म द्वारा नजर रखी है.
Protocol
1) अभिकर्मकों और उपकरण
- सबसे पहले, निम्नलिखित तीन समाधान तैयार: समाधान के 1 एमएल जो 8 मिमी एल lysine, 100 मिमी 2 सोडियम से बना है - (एन morpholino) ethanesulphonic एसिड (एमईएस) 6.5 पीएच, 0.2 nucleotide मिमी, जहां nucleotide है या तो: ग्वानोसिन diphosphate (जीडीपी), ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी), ग्वानोसिन 5'-diphosphate, 3'-diphosphate (ppGpp), या ग्वानोसिन 5'-triphosphate, 3'-diphosphate (pppGpp), 0.1 मिमी pyridoxal 5'फॉस्फेट (पीएलपी), और 1 मिमी / β mercaptoethanol (β-ME). समाधान बी 1 एमएल है जो 100 मिमी सोडियम एमईएस 6.5 पीएच 0.1 मिमी, पीएलपी, 1 मिमी β ME, और 50 एनएम LdcI के होते हैं. LdcI Snider एट अल के रूप में वर्णित शुद्ध 6 Kanjee और एट अल 14 .
समाधान सी जो समाधान बी के समान है, लेकिन LdcI शामिल नहीं की 1 एमएल. - बंद एक 96 अच्छी तरह से योग्य polystyrene प्लेट का उपयोग कर एक मल्टी चैनल पिपेट की प्रत्येक अच्छी तरह में 1 एम सोडियम कार्बोनेट (10.6 g/100 एमएल) और 50 μL विभाज्य से मिलकर समाधान के 100 एमएल तैयार करें. थाली करने के लिए पानी की 30 μL जोड़ें और फिर कवर. ध्यान दें कि पानी की मात्रा की राशि जोड़ी और एंजाइम की प्रतिक्रिया के दौरान निकाले नमूना की मात्रा 50 μL बराबर होना चाहिए. इस मामले में, एंजाइम की प्रतिक्रिया नमूना के 20 μL हटा दिया जाएगा.
- 10 मिमी पर TNBS समाधान के 5 एमएल और 4706 μL पानी, रैप के साथ एल्यूमीनियम पन्नी में 5% की μL 294 (w / v) TNBS शेयर गिराए द्वारा तैयार बर्फ पर रख.
- Eppendorf थर्मोस्टेट संतुलित प्लस 37 में डिग्री सेल्सियस थर्मोस्टेट प्लस 6 स्तंभों में 24 कुओं है. योजनाबद्ध के लिए चित्र 2 देखें. लेबल 1.5 एमएल Eppendorf nucleotide की पहचान है कि परीक्षण किया जाएगा (प्रति एक स्तंभ) का संकेत ट्यूबों: GTP (स्तंभ A), सकल घरेलू उत्पाद (स्तंभ B), ppGpp (स्तंभ सी), pppGpp (स्तंभ डी), कोई nucleotide (स्तंभ ई ), और प्रोटीन के नमूने (एफ स्तंभ).
- रैक 200 μL ऐसी है कि प्रत्येक वैकल्पिक पंक्ति सुझावों के चार पंक्तियों की एक कुल देने के लिए छोड़ा गया है सुझावों के कई बक्से. यह थर्मोस्टेट प्लस एंजाइम परख के दौरान heatblock के साथ मल्टी चैनल विंदुक के उपयोग के लिए आवश्यक है.
- 42 में डिजिटल Heatblock (VWR) संतुलित डिग्री सेल्सियस
- 96 अच्छी तरह से 2.0 बर्फ पर एमएल polypropylene थाली करने के लिए शांत रखें.
2) LdcI परख
- विभाज्य समाधान के 50 μL Eppendorf थर्मोस्टेट के पांच स्तंभों में से प्रत्येक में 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूबों के लिए उपयुक्त nucleotide के साथ.
- स्तंभ एफ में तीन ट्यूबों के समाधान बी 330 μL जोड़ें और एफ स्तंभ में अंतिम ट्यूब समाधान सी (नियंत्रण नहीं प्रोटीन) के 330 μL जोड़ने
- 37 पर समाधान संतुलित ° पांच मिनट के लिए सी. युक्ति: 5 मिनट के बाद, हीटिंग ब्लॉक के केंद्र में बंद ट्यूबों के टोपी में कटौती करने के लिए multichannel विंदुक के बगल में इस्तेमाल किया जा के साथ हस्तक्षेप से उन्हें रोकने के.
- स्तंभ में एफ ट्यूब से एई स्तंभों में ट्यूब के प्रत्येक में एक 5-50 μL VWR मल्टी चैनल पिपेट, स्थानांतरण 50 μL का उपयोग. टाइमर के रूप में जल्द ही के रूप में पहली ट्यूब मिश्रित है शुरू करो.
- से कम 2, 4, और 6 मिनट विंदुक नमूना मल्टी चैनल का उपयोग कर के 20 μL हटाने और स्थान पर समाधान करने के लिए जोड़ने.
- नोट: रोकने के समाधान में नमूने प्लास्टिक की चादर में कवर किया जा सकता है और बाद के प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए. प्लेटें TNBS के साथ प्रतिक्रिया से पहले कमरे के तापमान पर thawed होना चाहिए.
3) TNBS रिएक्शन और रंग विकास
- 10 मिमी TNBS बंद 6 मिनट के लिए बहु चैनल विंदुक और फिर 42 पर सेते ° सी का उपयोग कर समाधान के लिए समाधान के 50 μL जोड़ें. समाधान एक अंधेरे पीला / नारंगी रंग की बारी के रूप में TNBS lysine और cadaverine के साथ प्रतिक्रिया करता है.
- 6 मिनट के बाद, बर्फ पर थाली शांत करने के लिए नीचे धीमी प्रतिक्रिया.
- 2 एमएल गहरी अच्छी तरह से थाली है कि बर्फ पर ठंडा किया गया था में एक VWR 20-200 μL विंदुक मल्टी चैनल और जगह का उपयोग कर नमूने के 100 μL निकालें. Fumehood के लिए बर्फ बाल्टी स्थानांतरण.
- 500 अच्छी तरह से (ब्रांड) HandyStep दोहराने pipettor और 12.5 एमएल विंदुक टिप (Plastibrand) का उपयोग कर प्रत्येक के लिए टोल्यूनि μL जोड़ें.
- दूर किसी भी अतिरिक्त एक kimwipe का उपयोग टोल्यूनि पोछो और पैकेजिंग टेप के स्ट्रिप्स के साथ थाली को कवर. मजबूती से नीचे प्रेस करने के लिए एक अच्छा मुहर प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें. एक फ्लैट ढक्कन के साथ कवर 96 अच्छी तरह से थाली और फिर 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए सख्ती से हिला.
- समाधान के 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए छोड़ दें. TNP cadaverine ऊपरी टोल्यूनि चरण में अब है, जबकि TNP lysine घुलनशील (चित्रा 1 देखें) पानी रहता है.
- टोल्यूनि पढ़ने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली में 20-200 μL विंदुक मल्टी चैनल का उपयोग कर के 200 μL निकालें. नोट: जाँच करें कि प्रत्येक नमूना हटाया जा रहा है स्पष्ट है और नीचे जलीय चरण के किसी भी नहीं सुनिश्चित करें. नोट: उपयोग बाधा टोल्यूनि द्वारा मल्टी चैनल विंदुक नुकसान को रोकने के.
- SpectraMax 340 प्लेट रीडर में 340 एनएम पर absorbance पढ़ें.
- क्वार्ट्ज प्लेट साफ करने के लिए, पानी के साथ बाहर टोल्यूनि कुल्ला और एक बड़ी क्वार्ट्ज थाली में जगहधूआं हुड में गिलास ट्रे. 70% (v / v) नाइट्रिक एसिड की एक 07:03 मिश्रण के 100 एमएल डालो: 95 (v / v)% इथेनॉल और एक दूसरे गिलास ट्रे के साथ क्वार्ट्ज प्लेट को कवर. चेतावनी: अत्यधिक एक्ज़ोथिर्मिक और कभी कभी विस्फोटक प्रतिक्रिया पहनने उचित संरक्षण है और यह सुनिश्चित करें कि धूआं हुड सैश कम 6 "स्तर के लिए सेट कर दिया जाता है ठंडा करने के बाद, पानी के साथ नाइट्रिक एसिड धोने और फिर 95% इथेनॉल..
4) प्रतिनिधि परिणाम
1) Cadaverine मानक वक्र (चित्रा 3)
परख के रूप में किसी भी एल lysine या LdcI बिना वर्णित है, लेकिन प्रदर्शन किया था और cadaverine के बजाय विभिन्न सांद्रता empirically परख के रैखिक श्रृंखला निर्धारित किया गया. 0.25 की एक 340 आयुध डिपो रैखिक परख थी, ~ cadaverine के 22 nmoles (चित्रा 3) करने के लिए इसी.
2 LdcI की गतिविधि) (चित्रा 4)
अकेले LdcI की गतिविधि के लिए 153.5 (18.1 ±) nmoles cadaverine मिनट 1 μg LdcI 1-6.5 पीएच. निर्धारित किया गया था 100 सुक्ष्ममापी GTP या सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) की उपस्थिति में LdcI की गतिविधि अप्रभावित है, लेकिन दृढ़ता से pppGpp और ppGpp (चित्रा 4) की उपस्थिति में हिचकते हैं (> 10 गुना).
चित्रा 1. LdcI प्रतिक्रिया के योजनाबद्ध आरेख. एल lysine decarboxylation प्रतिक्रिया के लिए सीओ 2 और cadaverine उत्पन्न के रूप में उच्च pH पर TNBS के साथ बाद में प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से दिखाया गया है एन, N'- bistrinitrophenylcadaverine (TNP cadaverine ) और एन, एन उत्पन्न 'bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine). फ़ान एट al.11 पर आधारित
चित्रा 2. Eppendorf थर्मोस्टैट के सेटअप 24 अच्छी तरह Eppendorf थर्मोस्टेट में नमूने के लेआउट के साथ परख के इस कदम का वर्णन (बोल्ड में संकेत) के साथ दिखाया गया है. तीर प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान के हस्तांतरण से संकेत मिलता है. 96 अच्छी तरह से थाली में स्थान पर समाधान करने के लिए प्रतिक्रिया समाधान के हटाना भी संकेत दिया है.
चित्रा 3. Cadaverine मानक वक्र. Cadaverine के nmoles बनाम 340 एनएम पर absorbance के एक भूखंड दिखाया गया है. त्रुटि सलाखों के कम से कम तीन स्वतंत्र मापन के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. सबसे अच्छा फिट की लाइन भी दिखाया गया है .996 के एक R2 है.
चित्रा 4. LdcI परख परिणाम है. LdcI गतिविधि की दर के एक साजिश (nmoles cadaverine में न्यूनतम 1 - μg 1 LdcI उत्पादित) 100 सुक्ष्ममापी GTP, सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी), pppGpp, ppGpp की उपस्थिति में और nucleotide के अभाव में दिखाया है . कड़े प्रतिक्रिया (पी) न्यूक्लीओटाइड्स ppGpp काफी बाधा LdcI गतिविधि करने में सक्षम हैं. त्रुटि सलाखों से कम से कम छह स्वतंत्र माप के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Discussion
Lysine decarboxylase परख में, TNBS एल lysine और cadaverine के प्राथमिक amines के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है TNP-lysine और TNP-cadaverine adducts (चित्रा 1) के रूप में. TNP-lysine पर carboxylic एसिड समूह की उपस्थिति के कारण, इस adduct पानी में घुलनशील रहता है, जबकि TNP-cadaverine, carboxylic एसिड समूह की कमी, 11 टोल्यूनि में विभाजन करने में सक्षम है. परख के इस प्रकार के अन्य प्रकार के अमीनो एसिड जहां एक carboxylic एसिड समूह की हानि प्रतिक्रिया के दौरान होता है है पर अधिक मोटे तौर पर उपयोग कर सकते हैं. यह inducible ओर्निथिन decarboxylase SpeF द्वारा एल ओर्निथिन decarboxylation polyamine 7 putrescine और inducible arginine decarboxylase AdiA द्वारा एल arginine के decarboxylation फार्म polyamine 4 agmatine फार्म के दौरान होता है है .
LdcI परख यहाँ वर्णित इन विट्रो में शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि के निर्धारण के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से विधि प्रदान करता है. इस परख के बड़े फायदे हैं:
i) एकाधिक का उपयोग प्रतिकृति प्रति प्रत्येक माप के सटीक प्रयोग में सुधार;
ii) परख प्रोटोकॉल के संशोधन के बिना बफर स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला (अलग पीएच, नमक, आदि एजेंट को कम करने) पर आयोजित किया जा सकता है;
iii) परख LdcI के vivo गतिविधि में सेल के विकास के दौरान excreted cadaverine की राशि का निर्धारण करके मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
इस परख के प्रमुख सीमाएं हैं:
मैं) प्रयोगों की संवेदनशीलता TNP-adducts के absorbance के रैखिक रेंज द्वारा सीमित हैं;
ii) एकाधिक प्रसंस्करण कदम प्रयोगात्मक त्रुटियों की भयावहता को बढ़ाने;
iii) नहीं सभी एमिनो एसिड decarboxylases प्रोटोकॉल के इस प्रकार के के लिए उत्तरदायी हैं. उदाहरण के लिए, inducible glutamic एसिड decarboxylases द्वारा decarboxylation / एल glutamic एसिड के GadA GadB γ अमीनो butyric एसिड, 2 TNBS adduct जिसमें से पानी में घुलनशील पक्ष श्रृंखला carboxylic एसिड की उपस्थिति की वजह से हो जाएगा उत्पन्न समूह.
ई. के एसिड तनाव प्रतिक्रिया के जैव रासायनिक जांच कोलाई अनुसंधान के एक विस्तार क्षेत्र है और हमें बेहतर ई. में तनाव प्रतिक्रिया के आणविक आधार को समझने के लिए अनुमति देगा कोलाई और संबंधित γ-proteobacteria है कि इसी तरह साल्मोनेला enterica serovar 12 typhimurium और विब्रियो हैजा 13 जैसे एसिड तनाव प्रतिक्रिया प्रणाली है . खोज की है कि LdcI गतिविधि कड़े प्रतिक्रिया नियामक ppGpp से हिचकते है इस प्रोटीन के नियमन में एक पहले से अज्ञात अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की गई है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम हमें जीवाणु उपभेदों, plasmids, और आवश्यक प्रोटोकॉल भेजने के लिए धन्यवाद डॉ. डॉ. माइकल Cashel (स्वास्थ्य, बेथेस्डा, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों). हम SpecraMax प्लेट पाठक के उपयोग के लिए डॉ. जॉन ग्लोवर (जैव रसायन विभाग, टोरंटो विश्वविद्यालय के) धन्यवाद. ब्रिटेन के एक राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा के स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति () NSERC, स्ट्रक्चरल बायोलॉजी में रोग से जुड़ा झिल्ली प्रोटीन के एक संस्थान कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान सामरिक प्रशिक्षण कार्यक्रम, और टोरंटो ओपन फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय के प्राप्तकर्ता है. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा वाह (एमओपी 67,210) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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