Summary
inducible 리진 탈카복실화효소의 활동은 톨루엔에 차등 용해도를 부가물을 형성 2,4,6 - trinitrobenzensulfonic의 소산으로 기판 L - 라이신과 제품 cadaverine을 반응에 의해 모니터링됩니다.
Abstract
1, 매우 낮은로 산도가 가을 수있는 포유류의 위장을 통해 통로를 포함하여 극단적인 산성 스트레스를 이겨낼 수있다 - 대장균은 산도 값 (9 산도 5) 다양한 범위에서 성장이 가능합니다 장용 박테리아입니다 로 산도 2월 1일부터 2일까지. 산성 산도의 생존, E. 이러한 광범를 활성화하려면 대장균은 양성자 종속적인 방식으로 decarboxylate 자신의 기판 아미노산이 때문에 내부 산도를 높여 그 네 가지 inducible 아미노산 decarboxylases을 가지고 있습니다. decarboxylases은 glutamic 산성 decarboxylases 가다와 GadB 3, 아르기닌 탈카복실화효소 AdiA 4 리진 탈카복실화효소 LdcI 5, 6 및 ornithine 탈카복실화효소 SpeF 7 포함되어 있습니다. 이러한 효소의 모든 공동 요소 8로 피리 독살 - 5' - phospate 활용과 신선한 기판 2 교환에 외부 매체 decarboxylation 제품을 제거 - 멤브레인 내부 기판 - 제품 antiporters와 함께 작동합니다. LdcI의 경우, 라이신 - cadaverine antiporter은 CadB라고합니다. 최근, 우리는 2.0 Å에 LdcI의 X - 선 결정 구조를 결정하고, 우리는 LdcI 엄격한 응답 조절기 구아 노신 5' - diphosphate, 3' - diphosphate (ppGpp)가 14 바운드 소설 작은 분자를 발견했다. 기하 급수적으로 성장하는 세포가 영양 부족이나 기타 스트레스 9 숫자 중 하나가 발생할 때 엄격한 응답이 발생합니다. 그 결과, 세포는 고정 위상 성장 10 기하 급수적인 성장의 변화에 culminating 신호 계단식으로 연결 ppGpp을 생산합니다. 우리는 ppGpp는 LdcI 14 특정 억제제는 것을 증명하고있다. 우리가 판 외 개발한 분석에서 수정된 라이신 탈카복실화효소 분석을 설명합니다. 11, 우리가 LdcI의 활동과 그 활동에 pppGpp / ppGpp의 효과를 결정하는 데 사용했다고. LdcI의 decarboxylation 반응은 L - 라이신의 α - 카르복시 그룹을 제거하고 이산화탄소 및 polyamine cadaverine (1.5 - diaminopentane) 5을 생산하고 있습니다. L - 라이신과 cadaverine는 각각 N, N' - bistrinitrophenylcadaverine (TNP - cadaverine)와 N, N' - bistrinitrophenyllysine (TNP - 라이신)을 생성하기 위해 높은 산도에서 2,4,6 - trinitrobenzensulfonic 산성 (TNBS)와 반응 수 있습니다 11. TNP - cadaverine은 후자가 (그림 1 참조)는 아니지만, 전 그런 톨루엔과 같은 유기 용제에 용해와 같이 TNP - 라이신으로부터 분리 수 있습니다. 분석의 선형 범위는 경험적으로 정화 cadaverine를 사용하여 결정되었다.
Protocol
1) 시약 및 장비
- 우선, 다음과 같은 세 가지 솔루션을 준비 : 솔루션 1 ML 8 MM L - 라이신, 100 MM 나트륨이 구성되어있는 A - (N - Morpholino) ethanesulphonic 산성 (MES) 산도 6.5, 뉴클레오 티드는 염기 0.2 MM, 중 : diphosphate 구아 노신 (GDP), 구아 노신 삼인산 (GTP), 구아 노신 5' - diphosphate, 3' - diphosphate (ppGpp) 또는 5' - 삼인산 구아 노신, 3' - diphosphate (pppGpp), 0.1 MM 피리 독살 5' - 인산 (PLP), 1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 / (β - ME). 100 MM 나트륨 MES 산도 6.5, 0.1 MM PLP, 1 MM β - ME, 50 nm의 LdcI 구성되어 솔루션 B 1 ML. 스나이더 외에 설명된대로 LdcI이 정화되었다. 6 Kanjee 외. 14.
솔루션 B와 동일하지만 LdcI를 포함하지 않는 솔루션 C 1 ML. - 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 - 웰 폴리스티렌 플레이트의 각 우물에 1 M의 나트륨 탄산염 (10.6 g/100 ML)과 나누어지는 50 μL로 구성된 중지 솔루션의 100 ML를 준비합니다. 접시에 물을 30 μL를 추가하고 다음 커버. 물 수용량의 합계가 추가되고 효소 반응 동안 추출한 시료의 부피가 50 μL를 동일해야합니다. 이 경우에는, 효소 반응 시료 20 μL가 삭제됩니다.
- 알루미늄 호일에 4,706 μL 물, 랩 5 %를 294 μL (W / V) TNBS 주식을 diluting 10 MM에서 TNBS 솔루션의 5 ML을 준비하고 얼음 계속.
- Eppendorf의 온도를 평형 플러스 37 ° C. 온도 조절기 플러스는 6 열 24 우물이 있습니다. 배선도를 그림 2를 참조하십시오. (열 당 하나) 테스트 될 뉴클레오 티드의 신분을 나타내는 라벨 1.5 ML Eppendorf 튜브 : GTP (열), GDP (열 B), ppGpp (C 열), pppGpp (열 D), 아니 뉴클레오 티드 (열 E ), 그리고 단백질 샘플 (열 F).
- 각각의 다른 행을 팁 4 열로 총을 제공 생략되는 등 200 μL 팁 랙 몇 상자. 이것은 효소 분석하는 동안 온도 플러스 heatblock과 함께 멀티 채널 피펫의 사용을 위해 필요합니다.
- 42 디지털 Heatblock (VWR)을 평형 ° C.
- 냉각 얼음에 96 - 웰 2.0 ML의 폴리 프로필렌 플레이트를 놓습니다.
2) LdcI 분석
- 솔루션 나누어지는 50 μL Eppendorf 온도 조절기의 다섯 기둥의 각 1.5 ML Eppendorf 튜브에 적절한 염기와 함께.
- 열 F 세 튜브에 솔루션 B의 330 μL를 추가하고 열 F.에서 최종 튜브에 솔루션 C (노 단백질 제어)의 330 μL를 추가
- 37 솔루션을 평형 ° C를 5 분 동안. 팁 : 5 분 후에 다음 사용할 수있는 멀티채널 피펫 방해에서 그들을 방지하기 위해 가열 블록의 중심에있는 튜브의 뚜껑을 잘라.
- 열 AE의 튜브의 각으로 열 F에있는 튜브에서 5-50 VWR μL 멀티 채널 피펫, 이전 50 μL를 사용하여. 마자 첫 번째 튜브가 혼합으로 타이머를 시작합니다.
- 2, 4, 6 분 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘플을 20 μL를 제거하고 중지 솔루션에 추가할 수 있습니다.
- 참고 : 중지 솔루션 샘플 플라스틱 포장으로 덮여 이후 처리를 위해 -20 ° C에 냉동 수 있습니다. 접시는 TNBS로 반응하기 전에 상온에서 해동해야합니다.
3) TNBS 반응 및 색상 개발
- 육분에 대한 다음 멀티 채널 피펫 42에서 품어 ° C를 사용 중지 솔루션 10 MM의 TNBS 솔루션 50 μL를 추가합니다. TNBS은 라이신과 cadaverine와 반응으로 솔루션은 어두운 노란색 / 오렌지 색상을 설정합니다.
- 육분 후, 반응을 느리게하기 위해 얼음 접시를 냉각.
- 얼음 냉각되었다 2 ML 딥 웰 플레이트에 VWR 20-200 μL 다중 채널 피펫과 장소를 사용하여 샘플을 100 μL를 제거합니다. fumehood에 얼음 양동이를 전송합니다.
- 잘 HandyStep (브랜드) 반복 pipettor와 12.5 ML 피펫 팁 (Plastibrand)를 사용하여 각 톨루엔 500 μL를 추가합니다.
- kimwipe를 사용하여 초과 톨루엔을 닦아 및 포장 테이프의 스트립과 접시를 커버. 좋은 도장을 얻기 위해 단단히 눌러해야합니다. 평면 뚜껑과 96 - 웰 플레이트를 커버하고 1 분 30 초 동안 적극적으로 흔들.
- 솔루션 5 분 정착을 둡니다. TNP - 라이신은 물 (그림 1 참조) 가용성 유지하면서 TNP - cadaverine은 상단 톨루엔 단계에 지금있다.
- 톨루엔은 독서를위한 96 - 웰 플레이트에 20-200 μL 멀티 채널 피펫을 사용하여 200 μL를 제거합니다. 참고 : 제거하는 각 샘플이 명확하고 아래 수성 단계 중 하나가없는 것을 확인할 수 있는지 확인합니다. 참고 : 톨루엔의 멀티 채널 피펫의 손상을 방지하기 위해 사용 장벽 팁.
- SpectraMax 340 플레이트 판독기에서 340 nm의 흡광도에서를 읽으십시오.
- 석영 판을 청소하려면 물로 톨루엔을 씻어 대형의 석영 판을 배치펌 후드에 유리 트레이. 70% (V / V) 질산의 산성의 7시 3분 혼합 100 ML 이상 붓고 : 95 % (V / V) 에탄올과 두 번째 유리 트레이와 석영 판을 커버. 경고 : 반응이 높은 발열과 때로는 폭발적인 마모 적절한 보호되고 퓸 후드 허리띠가 낮은 6 "레벨로 설정되어 있는지 확인 냉각 후 물을 질산을 씻어 후 95 % 에탄올..
4) 대표 결과
1) Cadaverine 표준 곡선 (그림 3)
분석은 같은 L - 라이신 또는 LdcI없이 설명하지만, 수행되었으며 cadaverine 대신에 다양한 농도는 경험적으로 분석의 선형 범위를 결정하는 데 사용되었습니다. 분석은 cadaverine의 ~ 22 nmoles (그림 3)에 해당, 0.25의 OD 340 선형했다.
LdcI 2) 활동 (그림 4)
혼자 LdcI의 활동은 153.5 (± 18.1) nmoles cadaverine 분 - 1 산도 6.5에서 μg LdcI - 1. 것으로 결정되었다 LdcI의 활동은 100 μm의 GTP 또는 GDP의 존재에 영향을받지 않지만 강하게 pppGpp 및 ppGpp (그림 4)의 존재 (> 10 배) 저해합니다.
그림 1. LdcI 반응의 개략도 다이어그램. CO 2와 cadaverine를 생성하는 L - 라이신의 decarboxylation 반응은 N, N' - bistrinitrophenylcadaverine (TNP - cadaverine)과 N, N을 생성뿐만 아니라 높은 산도에서 TNBS로 후속 반응으로 보여집니다 '- bistrinitrophenyllysine (TNP - 라이신). 판 동부 표준시 al.11에 따라
그림 2. Eppendorf 온도 조절기의 설정은. 24 잘 Eppendorf 온도 조절기에있는 샘플의 배치는 분석의 단계에 대한 설명 (굵게 표시)와 함께 표시됩니다. 화살표는 프로토콜에 따라 반응 솔루션의 전송을 나타냅니다. 96 - 웰 플레이트에 중지 솔루션에 대한 반응 솔루션의 제거도 표시됩니다.
그림 3. Cadaverine 표준 곡선은. cadaverine의 nmoles 비교 340 nm의 흡광도에서의 플롯이 표시됩니다. 오차 막대는 적어도 세 독립 측정의 표준 편차를 나타냅니다. 가장 적합의 라인도 표시와 0.996의 R2를 가지고있다.
그림 4. LdcI 분석 결과. LdcI 활동의 속도의 줄거리는 100 μm의 GTP, GDP, pppGpp, ppGpp의 존재와 염기의 부재에 표시됩니다 (nmoles cadaverine에서 분 - 1 μg - 1 LdcI을 생산). 엄격한 응답 세포핵 (P) ppGpp 크게 억제 LdcI 활동 할 수 있습니다. 오차 막대는 적어도 6 독립 측정의 표준 편차를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
리진 탈카복실화효소 분석에서 TNBS은 TNP - 라이신과 TNP - cadaverine 부가물 (그림 1)을 형성 L - 라이신과 cadaverine의 기본 아민과 반응입니다. 카르복실산 그룹을 부족 TNP - cadaverine은, 톨루엔 11로 분할 할 수있는 동안 TNP - 라이신의 카르복실산 그룹의 존재로 인해,이 adduct은 물에 용해 남아 있습니다. 분석의이 유형은 카르복실산 그룹의 손실이 반응 중에 발생하는 아미노산의 다른 유형에 대한 자세한 광범위하게 활용하실 수 있습니다. 이것은 polyamine agmatine 4 형태 inducible 아르기닌 탈카복실화효소 AdiA하여 polyamine putrescine 7 L - 아르기닌의 decarboxylation를 형성하는 inducible의 ornithine 탈카복실화효소 SpeF하여 L - ornithine의 decarboxylation하는 동안 발생합니다.
LdcI 분석 여기에 설명된 내용은 체외에서 정화 단백질의 활동의 결정에 대해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 이 분석의 주요 장점은 다음과 같습니다
실험은 각 측정의 정밀도를 향상 당 전) 여러의 사용은 복제;
ii) 본 분석은 프로토콜의 수정없이 버퍼 조건의 넓은 범위 (등 환원제 다른 산도, 소금,)을 통해 실시있을 수 있습니다;
3) 분석은 세포 성장 동안 배설 cadaverine의 양을 결정하여 LdcI의 생체내 활동을 측정하는 수정할 수 있습니다.
이 분석의 주요 제한은 다음과 같습니다
제가 실험) 감도는 TNP - 부가물의 흡광도의 선형 범위에 의해 제한됩니다;
II) 여러 처리 단계는 실험 오류의 크기를 증가;
3) 모든 아미노산 decarboxylases는 프로토콜 이런 종류의 의무가 있습니다. 예를 들어, inducible glutamic 산성 decarboxylases에 의해 L - glutamic 산성의 decarboxylation는 가다 / GadB는 γ - 아미노 버터의 산 2, 때문에 사이드 체인 카르복실산의 존재에 물에 용해 될 중 TNBS - adduct 생성 그룹.
E.의 산성 스트레스 반응의 생화 학적 조사 대장균 연구의 확대 영역이며 우리가 더 나은 E.에 스트레스 응답의 분자 기초를 이해하실 수 있습니다 대장균과 살모넬라균 등 관련 enterica serovar Typhimurium 12 비브리오 콜레라 13와 유사한 산성 스트레스 응답 시스템을 가지고 γ - proteobacteria. LdcI 활동은 엄격한 응답 조절기 ppGpp에 의해 저해되는 발견이 단백질의 규정에 이전에 알려지지 않은 통찰력으로 우리를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리에게 박테리아 변종, plasmids, 필요한 프로토콜을 보내는 박사 마이클 카쉘을 (건강, 베데스다, MA, 미국의 국립 연구소) 감사합니다. 우리는 SpecraMax 플레이트 리더 사용에 대한 박사 존 글로버를 (생화학학과, 토론토 대학) 감사합니다. 영국 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC) 대학원 장학금, 질병에 링크된 막 단백질의 구조 생물의 건강 연구 전략 훈련 프로그램의 캐나다 연구소, 그리고 토론토 오픈 원정대의 대학의받는 사람입니다. 이 작품은 WAH로 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 - 67210)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
