Summary
2,4,6 - trinitrobenzensulfonic酸反应的底物L -赖氨酸和产品尸形成加合物在甲苯的溶解度差，诱导赖氨酸脱羧酶的活动都受到监控。
Abstract
大肠杆菌是肠道细菌能够较广泛的pH值（pH值5 - 9）增长1的，令人难以置信的，是能够生存的极端酸强调，通过哺乳动物的胃pH值下降，包括通过低作为pH值1 - 2 2。为了使这样一个广泛偏酸生存，E.大肠杆菌拥有四种不同的诱导氨基酸decarboxylases decarboxylate基板在质子依赖性氨基酸，从而提高内部的pH值。 decarboxylases包括谷氨酸decarboxylases嘎达和GadB 3，精氨酸脱羧酶ADIA 4，赖氨酸脱羧酶LdcI 5，6和7鸟氨酸脱羧酶SPEF。所有这些酶的利用吡哆醛-5 -磷酸作为共同因子8，函数内的膜基板产品逆向转运，删除脱羧产品在外部介质换取新鲜的基板2。在LdcI的情况下，赖氨酸尸逆向转运蛋白被称为农发行。最近，我们确定了X射线晶体结构的LdcI 2.0 A，我们发现了一个新的小分子绑定到LdcI严格的反应调节鸟苷5' -二磷酸，3' -二磷酸果糖（ppGpp）14 。严格的反应时，会发生细胞急剧增长的经验营养剥夺或其他9讲。因此，细胞产生ppGpp导致信号级联，最终从指数的增长转移到固定相增长10。我们已经证明，ppGpp是LdcI 14特异性抑制剂。在这里，我们描述赖氨酸脱羧酶检测，修改从藩等人开发的的实验。11，我们用于确定LdcI活动pppGpp / ppGpp该活动的影响。 LdcI脱羧反应，消除了L -赖氨酸的α-羧基组和产生的二氧化碳和尸胺（1,5 - diaminopentane） 5。 L -赖氨酸和尸，可在高pH值2,4,6 trinitrobenzensulfonic酸（TNBS）反应生成N，N - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -尸）和N，N' - bistrinitrophenyllysine（TNP -赖氨酸），分别11。 TNP -尸可以分开，前者是可溶于有机溶剂，如甲苯，而后者则没有（见图1），TNP -赖氨酸。检测的线性范围为使用纯化尸凭经验确定。
Protocol
1）试剂和仪器
- 首先，准备以下三种解决方案：1 mL的溶液A，它是由L -赖氨酸8毫米，100毫米的钠2 - （N -吗啉）ethanesulphonic酸（MES），pH值6.5，0.2毫米核苷酸，核苷酸无论是：鸟苷二磷酸总值（GDP），三磷酸鸟苷（GTP），5' -鸟苷二磷酸，3' -二磷酸果糖（ppGpp），或5' -鸟苷三磷酸，3' -二磷酸（pppGpp），0.1毫米哆5' -磷酸（PLP），1毫米β-巯基乙醇/（β- ME）。 1毫升溶液B，包括100毫米钠MES的pH值6.5，0.1毫米工党，1毫米的β- ME公司和50 nm LdcI。 LdcI纯化斯奈德等 6和Kanjee 等 。14。
1毫升溶液C溶液B相同，但不包含LdcI。 - 准备100毫升的一站式解决方案，为每孔96孔聚苯乙烯板，使用多道移液器1米碳酸钠（10.6 g/100毫升）和分装50μL的组成。加入30μL水盘，然后覆盖。注意增加水量的总和，并在酶反应中提取的样本量必须等于50微升。在这种情况下，20μL酶反应样品将被删除。
- 4706μL水，包裹在铝箔稀释294μL5％（W / V）TNBS股票准备在10毫米的TNBS溶液5毫升，并保持在冰上。
- 平衡的Eppendorf恒温器加在37 ° C恒温器加在6列有24个井。原理图参见图2。标签1.5 mL的Eppendorf管中表示，将被测试（每列）的核苷酸的身份：GTP（列A），国内生产总值（B列），ppGpp（C列），pppGpp（D列），没有核苷酸（E列）和蛋白质样品（F列）。
- 机架几箱200μL，提示等，每个交替行省略总给人一种四排提示。这是在酶的检测与温控器加heatblock使用多道移液器必要。
- 平衡数字Heatblock（VWR）在42 ° C。
- 将上冰96孔2.0 mL聚丙烯板冷却。
2）LdcI含量
- 分装50μL溶液1.5毫升的Eppendorf管中的Eppendorf恒温5列每个相应的核苷酸。
- 加入330μL溶液B三个F列管，并添加330μL溶液C（无控制蛋白质的）列F中的最后管
- 平衡的解决方案，在37 ° C的五分钟。提示：5分钟后，切断在加热块中心的管帽，以防止他们干扰下一步要使用的多道移液器的。
- 从F列管到每个曝光在列管使用一个5-50微升VWR多通道移液器，转让50微升。管头混合尽快启动定时器。
- 2，4和6分钟，取出20μL的样品使用多道移液器和一站式解决方案。
- 注：一站式解决方案的样品可以覆盖保鲜膜，并冻结在-20 ° C进行后续处理。板应与TNBS反应前在室温下解冻。
3）TNBS反应和颜色开发
- 加入50μL10 mM的TNBS解决方案的一站式解决方案，使用多通道移液器，然后孵育42 ° C 6分钟。该解决方案将变成一个暗黄色/橙色作为TNBS与赖氨酸和尸胺反应。
- 6分钟后，在冰上冷却板减慢反应。
- 取出100μL的样品使用一个VWR 20-200μL多通道移液器和地点，在2毫升深孔板在冰上冷却。转让冰水桶的通风柜。
- 添加500μL，每口井使用HandyStep（品牌）重复移液器和12.5毫升枪头（Plastibrand）的甲苯。
- 擦去多余的甲苯，使用一个kimwipe和罩板包装胶带条。确保稳固地向下按压，取得了良好的密封。与平盖盖96孔板，然后大力握手为1分30秒。
- 离开的解决方案，以解决5分钟。 TNP -尸现在是在上层的甲苯阶段，而TNP -赖氨酸仍然溶于水（见图1）。
- 取出200μL甲苯20-200μL多道移液器使用到96孔板为阅读。注意：确保检查被删除每个样品是明确的，没有任何底部的水相。注意：使用屏障的提示，以防止甲苯多通道移液器损坏。
- 阅读在SpectraMax 340酶标仪在340 nm处的吸光度。
- 要干净的石英石板材，冲洗出来的甲苯与水，并放置在一个大的石英石板材通风柜的玻璃托盘。倒入100毫升的70％（V / V）硝酸的7:3的混合物：95％（V / V）乙醇，涵盖了第二个玻璃托盘的石英石板材。警告：反应是高度放热反应，有时爆炸穿适当的保护，并确保通风柜绦设置为低6“级，冷却后，用清水洗出硝酸，然后95％的乙醇。
4）代表性的成果
1）尸标准曲线（图3）
检测是描述没有任何L -赖氨酸或LdcI，但和不同浓度的尸，而不是被用来凭经验判断检测的线性范围。该法线性0.25外径340，对应〜22 nmoles尸（图3）。
2）活动的LdcI（图4）
LdcI单独的活动被确定为153.5（± 18.1）nmoles尸min - 1的LdcI在pH值6.5 - 1微克。 LdcI活动是在100微米GTP或GDP的存在的影响，但强烈的抑制作用pppGpp和ppGpp（图4）的存在（> 10倍）。
图1。 L -赖氨酸的LdcI反应示意图。脱羧反应生成CO 2和尸，以及随后在高pH值TNBS反应生成N，N - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -尸）和N， N “bistrinitrophenyllysine（TNP -赖氨酸）。基于藩等al.11
图2。 Eppendorf公司温控器的安装 。布局在24孔的Eppendorf恒温样品检测步骤的描述（黑体表示）。箭头指示的反应，根据该协议解决方案的转移。也表示去除反应液在96孔板的一站式解决方案。
图3。尸标准曲线的吸光度在340纳米，与尸nmoles情节所示。误差棒代表至少有三个独立的测量的标准偏差。最佳拟合线也显示，有一个R2为0.996。
图4。 LdcI检测结果。情节LdcI活动率（nmoles尸制作1分钟1微克LdcI）pppGpp，ppGpp 100μM的GTP，GDP和核苷酸的情况下显示。严格的响应核苷酸（P）ppGpp能显着抑制LdcI活动。误差棒代表至少6个独立的测量的标准偏差。
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Discussion
赖氨酸脱羧酶试验，TNBS是L -赖氨酸和尸伯胺反应形成，TNP -赖氨酸和TNP -尸加合物（图1）。由于TNP -赖氨酸的羧酸基团的存在，这种加合物仍然易溶于水，而TNP -尸，缺乏羧酸 ，甲苯11分区。其他类型羧酸组的损失发生在反应过程中的氨基酸，可以更广泛地利用这类型的检测。这发生在L -鸟氨酸诱导鸟氨酸脱羧酶SPEF的脱羧形成多胺腐胺和L -精氨酸脱羧诱导精氨酸脱羧酶ADIA形成多胺胍丁胺 4 。
这里所描述的LdcI检测提供了一个比较快的方法，在体外纯化的蛋白质的活动的决心。这个实验的主要优点是：
I）使用多个复制每个实验提高了每次测量的精度;
II）检测进行了广泛的缓冲条件（不同的pH值，盐，还原剂等）无需修改的协议;
iii）该法可能会被修改为测量在体内的LdcI活性细胞生长过程中排出的量确定的尸。
这个实验的主要限制是：
我）的实验的灵敏度是有限的，TNP -加合物的吸光度的线性范围;
II）的多个处理步骤增加实验误差的大小;
III）并非所有的氨基酸decarboxylases都适合这种类型的协议。例如，嘎达/ GadB诱导谷氨酸decarboxylases L -谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸2，TNBS -加合物将易溶于水，由于存在的侧链羧酸组。
生化调查的E.酸应激反应大肠杆菌是研究扩大面积，将使我们能够更好地了解在大肠杆菌中应激反应的分子基础大肠杆菌和相关的γ-变形菌有类似的酸应激反应系统，如沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌和 霍乱弧菌13。 LdcI活动是由严格的反应调节ppGpp抑制，这一发现已为我们提供了一个以前未知的洞察到这种蛋白质的调节。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢博士博士迈克尔卡舍尔（，贝塞斯达，MA，美国国家卫生研究院）向我们发送菌株，质粒和必要的协议。我们感谢SpecraMax酶标仪约翰格洛弗（博士，加拿大多伦多大学生物化学系）。英国是一个国家科学与工程研究理事会，加拿大（NSERC）的研究生奖学金，加拿大在与疾病相关的膜蛋白的结构生物学研究所的卫生研究战略培训计划，及多伦多大学打开奖学金获得者。这项工作是支持由授予的加拿大卫生研究院（澳门币67210）往华。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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