Summary
誘導性リジン脱炭酸酵素の活性は、基質のL -リジンとトルエンで、差動溶解度を持っている付加体を形成するために、2,4,6 - trinitrobenzensulfonic酸による製品のカダベリンを反応させることによって監視されます。
Abstract
1と、信じられないほど、低いとpHが落ちることができる哺乳類の胃の通過を含む極端な酸応力に耐えることができるか- 大腸菌では、pH値（9 pHは5）の広い範囲で成長することができる腸内細菌です。 2 2 - pHを1として。酸性pHの生存、E.のような広い範囲を有効にするには大腸菌は、プロトン依存的に脱炭酸、その基質のアミノ酸はこのように内部のpHを上げることつの異なる誘導アミノ酸decarboxylasesを持っています。 decarboxylasesはグルタミン酸decarboxylasesガダとGadB 3、アルギニンデカルボキシラーゼ不透過4、リジン脱炭酸酵素LdcI 5、6、オルニチンデカルボキシラーゼSPEF 7を含める。これらの酵素のすべてが新鮮な基板2と引き換えに、外部媒体への脱炭酸の製品を削除する内側の膜基板-製品のアンチポーターと一緒にコファクター8および関数としてピリドキサール5' - phospateを利用する。 LdcIの場合には、リジン-カダベリンアンチポーターはCADBと呼ばれています。最近、我々は、2.0 ÅにLdcIのX線結晶構造を決定し、そして我々はLdcI厳しいレスポンスレギュレーターのグアノシン5' -二リン酸、3' -二リン酸（ppGppの）14に結合した新規の低分子化合物を発見した。指数関数的に成長する細胞が栄養枯渇や他のストレス9の数字のいずれかが発生するときに緊縮応答が発生します。その結果、細胞が定常期の成長率は10〜急激な成長からのシフトで最高潮に達するシグナル伝達カスケードにつながるppGppのを作り出す。我々は、ppGppのはLdcI 14の特異的阻害剤であることが実証されている。ここでは、ファンティエットらによって開発されたアッセイから変更。11、我々はLdcIの活動とその活動上pppGpp / ppGppのの効果を決定するために使用されていることを、リジン脱炭酸酵素のアッセイを説明します。 LdcIの脱炭酸反応は、L -リジンのα-カルボキシ基を除去し、二酸化炭素とポリアミンカダベリン（1,5 -ジアミノペンタン）5を生成します。 L -リジンとカダベリンは、それぞれ、N、N' - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -カダベリン）とN、N' - bistrinitrophenyllysine（TNP -リジン）を生成するために、高pHで2,4,6 - trinitrobenzensulfonic酸（TNBS）と反応させることができます。 11。後者は（図1参照）ではない。前者はトルエンなどの有機溶媒に可溶であるとしてTNP -カダベリンは、TNP -リジンから分離することができる。アッセイの直線範囲は、経験的に精製カダベリンを用いて決定した。
Protocol
1）試薬および器具
- 最初に、以下の3つのソリューションを準備する：溶液1 mLの8ミリL -リジン、100 mMリン酸ナトリウム2で構成されている - （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）pH6.5で、ヌクレオチドが塩基0.2mMの、どちらか：グアノシン二リン酸（GDP）、グアノシン三リン酸（GTP）、グアノシン5' -二リン酸、3' -二リン酸（ppGppの）、または5' -三リン酸、3' -二リン酸（pppGpp）グアノシン、0.1mMのピリドキサール5' -リン酸（PLP）、および1mMβ-メルカプトエタノール/（β- ME）。 100mMの塩化ナトリウムMES pH6.5で、0.1mMのPLP、1mMのβ- ME、および50 nMのLdcIから成るソリューションBを1mL。スナイダーら 6 Kanjee らに説明したようにLdcIを精製した。14。
ソリューションBと同一だLdcIを含まない溶液Cの1mL。 - マルチチャンネルピペットを用いて96穴ポリスチレンプレートの各ウェルに、1Mの炭酸ナトリウム（10.6 g/100 mL）に、アリコート50μLから成る反応停止液100 mLを準備する。プレートに水30μLを追加してから、カバーしています。水の体積の和が追加され、酵素反応の間に抽出されたサンプルの量が50μLに等しくなければならないことに注意してください。この場合、酵素反応の試料の20μLを削除されます。
- アルミホイルで4706μL水、ラップで5％の294μL（w / v）のTNBSの株式を希釈して10 mMのでTNBS溶液5mlを調製し、氷上に置きます。
- エッペンドルフのサーモスタットを平衡化するプラス37℃サーモスタットプラス6列の24個のウェルを持っている。回路図、図2を参照してください。 （列ごと）にテストされるヌクレオチドの同一性を示すラベル1.5mLのエッペンドルフチューブ：GTP（列）、GDP（列B）、ppGppの（列C）、pppGpp（列D）、無ヌクレオチド（カラムE ）、およびタンパク質サンプル（列F）。
- 各代替行がヒントの4行の合計を与えて省略されているように、200μLのヒントのラックいくつかの箱。これは、酵素アッセイの間にサーモスタットプラスheatblockとマルチチャンネルのピペットを使用するために必要です。
- 42でデジタルHeatblock（VWR）を平衡℃に
- 冷却するために氷上で96ウェル2.0mLのポリプロピレン板を置きます。
2）LdcIアッセイ
- エッペンドルフのサーモスタットの5つの列のそれぞれに1.5mlのエッペンドルフチューブに適切なヌクレオチドと溶液のアリコート50μL。
- F列の3本のチューブに溶液B 330μLを追加し、列Fの最後のチューブに溶液C（無タンパク質の制御）330μLを加える
- 37ソリューションを平衡℃で5分間。ヒント：5分後、次に使用するマルチチャンネルピペットが干渉するのを防ぐために、加熱ブロックの中心にチューブのキャップを切断。
- 列AEの各チューブに50から50μLVWRマルチチャンネルピペット、F列の管からの転送50μLを使用する。とすぐに最初のチューブが混ざっているようにタイマーを開始します。
- 2、4、6分でマルチチャンネルピペットを用いて試料の20μLを削除し、ワンストップソリューションに追加します。
- 注：停止溶液中の試料をプラスチック覆いで覆われ、その後の処理のために-20℃で凍結することができます。プレートは、TNBSと反応させる前に室温で解凍してください。
3）TNBSの反応と色の開発
- 6分間後、マルチチャンネルピペットと42℃でインキュベートCを使用して停止液に10mMのTNBS溶液50μLを追加。 TNBSは、リジンとカダベリンと反応するようなソリューションでは、暗い黄色/オレンジ色に変わります。
- 6分後、反応を遅らせるために氷の上でプレートを冷却する。
- 氷上で冷却し、2 mLのディープウェルプレートでVWR 20〜200μLマルチチャンネルピペットと場所を使用してサンプル100μLを削除します。 fumehoodにアイスバケットを転送する。
- よくHandyStep（ブランド）リピートピペッターと12.5 mLのピペットチップ（Plastibrand）を使用して、それぞれにトルエン500μLを追加。
- キムワイプを使用して余分なトルエンを拭うと包装テープのストリップとプレートをカバーしています。良好なシールを得るためにしっかりと下に押してください。平らな蓋付き96ウェルプレートをカバーし、1分30秒間激しく振る。
- 5分のために解決するソリューションを残す。 TNP -リジンは、水溶性のまま、TNP -カダベリンは、（図1参照）、上部のトルエン相に入りました。
- 読書のための96ウェルプレートに20〜200μLマルチチャンネルのピペットを用いてトルエン200μLを削除します。注意：削除する各サンプルが明確であり、下部水相のいずれかを持っていないことを確認してください。注：トルエンによるマルチチャンネルピペットへの損傷を防止するために使用するバリアヒント。
- SpectraMax 340プレートリーダーで340nmの吸光度を読み取る。
- 石英板をクリーニングするには、水とトルエンを洗い落として、大規模で石英板を配置ドラフト内でガラス皿。 70％（v / v）の硝酸の午前7時03分混合物を100mLの上に注ぐ：95％（v / v）エタノールをし、第2のガラストレイを持つ石英プレートをカバーしています。警告：反応は非常に発熱し、時には爆発的に摩耗適切な保護であるとヒュームフードのサッシが低い6"レベルに設定されていることを確認冷却後、水で硝酸を洗い流し、その後95％エタノール。。
4）代表者の結果
1）カダベリン標準曲線（図3）
アッセイは、任意のL -リジンまたはLdcIなく説明するが、実行されたとカダベリンの代わりに種々の濃度は、経験的にアッセイの直線範囲を決定するために使用されていました。アッセイは、カダベリンの〜22ナノモル（図3）に対応する、0.25のOD 340まで線形であった。
LdcI 2）活性（図4）
単独でLdcIの活性は153.5（± 18.1）ナノモルカダベリン分-1μgのpH6.5のLdcI - 1と決定した。 LdcIの活動は、100μMのGTPまたはGDPの存在下で影響を受けることはありませんが強くpppGppとppGppの（図4）の存在下で（> 10倍）抑制される。
図1。 LdcIの反応の模式図。CO 2及びカダベリンを生成するために、L -リジンの脱炭酸反応は、N、N' - bistrinitrophenylcadaverine（TNP -カダベリン）とN、Nを生成するだけでなく、高pHでTNBSで次の反応を示されています'- bistrinitrophenyllysine（TNP -リジン）。ファンティエットら11に基づいて
図2。エッペンドルフのサーモスタットのセットアップ。24 -ウェルエッペンドルフサーモスタットのサンプルのレイアウトは、アッセイの手順の説明（太字で示されている）とともに示されています。矢印は、プロトコルに従って反応液の転送を示している。 96ウェルプレートでのワンストップソリューションへの反応液の除去にも示されています。
図3。カダベリン標準曲線。カダベリンのナノモルに対する340nmの吸光度のプロットが示されています。エラーバーは、少なくとも3つの独立した測定値の標準偏差を表しています。ベストフィットのラインも表示し、0.996のR2を持っています。
図4。 LdcIアッセイの結果。LdcIの活動の割合（ナノモルカダベリンのmin - 1μgの1 LdcIを生産）のプロットは、100μMのGTP、GDP、pppGpp、ppGppのと塩基の存在下での存在下で示されています。緊縮応答のヌクレオチド（P）ppGppのは著しく阻害LdcIの活動が可能です。エラーバーは、少なくとも6つの独立した測定値の標準偏差を表しています。
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Discussion
リジン脱炭酸酵素のアッセイでは、TNBSは、TNP -リジンとTNP -カダベリン付加体（図1）を形成するために、L -リジンとカダベリンの第一級アミンと反応させる。 TNP -カダベリンは、カルボン酸基を欠く、トルエン11に分割することができる間、TNP -リジン上にカルボン酸基の存在のために、この付加物は水に可溶のまま。このタイプのアッセイは、カルボン酸基の消失が反応中に発生するアミノ酸の他のタイプでより広く利用することができます。これは、ポリアミンアグマチン4を形成するためにポリアミンプトレシン7と誘導アルギニン脱炭酸酵素不透過によるL -アルギニンの脱炭酸を形成するために誘導オルニチン脱炭酸酵素SPEFによるL -オルニチンの脱炭酸の間に発生します。
ここで説明LdcIアッセイは、in vitroで精製されたタンパク質の活性の測定のための比較的高速な方法を提供する。このアッセイの主要な利点は次のとおりです。
実験では各測定の精度を向上させるごとに、私は）複数の使用は、複製します。
ⅱ）アッセイは、プロトコルの変更を加えることなく、バッファ条件の広い範囲（異なるpH、塩、エージェントなどを減らすこと）を介して行うことができる。
ⅲ）アッセイは、細胞増殖中に排泄されるカダベリンの量を決定することにより、LdcIのin vivo活性の測定用に変更されることがあります。
このアッセイの主要な制限は以下のとおりです。
ⅰ）実験の感度は、TNP -付加体の吸光度の直線範囲によって制限されます。
ⅱ）複数の処理ステップは、実験誤差の大きさを増加させる;
ⅲ）すべてのアミノ酸decarboxylasesは、プロトコルのこのタイプに適している。嘎達/ GadBは、γ-アミノ酪酸2を生成する例については、L -グルタミン酸の脱炭酸は、誘導性グルタミン酸decarboxylasesで、のTNBS -付加体は、側鎖カルボン酸の存在のために水に溶けるようになりますグループ。
E.の酸性ストレス応答の生化学的研究大腸菌は、研究の拡大面積であり、私たちはより良いE.におけるストレス応答の分子基盤を理解することができるようになります大腸菌とサルモネラ血清型ネズミチフス菌12およびコレラ菌 13などの同じような酸のストレス応答システムがあることをγ-プロテオバクテリアに関連する。 LdcI活動が厳しいレスポンスレギュレーターのppGppのによって阻害されるという発見は、このタンパク質の調節に未知の洞察を提供してくれました。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、私たち菌株、プラスミド、および必要なプロトコルを送信するための博士マイケルキャシェル（国立衛生研究所、ベセスダ、MA、米国）を感謝。我々はSpecraMaxプレートリーダーを使用するためにドクタージョングローバー（生化学部、トロント大学を）感謝。英国では、国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）大学院奨学金、疾病へのリンク膜タンパク質の構造生物学、およびトロントオープンフェローシップの大学における保健研究戦略的トレーニングプログラムのカナダの協会の受信者です。この作品は、カナダ衛生研究所（MOP - 67210）からWAHへの助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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