Summary
RNA 간섭 (RNAi) 기반 요법의 개발을위한, 소설 전략은 transkingdom RNAi (tkRNAi)를 개발하였습니다. 이 기술은 생산과 대상 세포로 치료 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 제공하는 비 병원성 박테리아를 사용합니다. 여기 tkRNAi가 성공적으로 암 세포의 고전 ABCB1 - 중재 multidrug 저항 (MDR)의 반전을 위해 적용되었다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 mRNA의 표현의 구체적인 억제를위한 높은 효과적인 메커니즘을 나타냅니다. 강력한 실험실 도구로서의 가능성이 외에도, RNAi 경로는 치료 활용에 대한 가능성 것으로 보인다. RNA 간섭 (RNAi) 기반 요법, 인도의 개발을위한 RNAi - 중재 대상 세포에 대리인 것이 가장 큰 장애물 중 하나입니다. 이 장애물을 극복하기 위해 소설 전략 transkingdom RNAi (TK RNAi)입니다. 이 기술은 생산과 RNAi를 유도하는 대상 세포로 치료 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 제공하는 이외의 병원성 세균, 예를 들어 대장균을 사용합니다. 첫 세대 TK RNAi - 중재 벡터, 여행, 관심의 치료 shRNA의 표현 규제에 대한 박테리오 파지 T7 프로 모터가 포함되어 있습니다. 또한, 여행 β1 - 인테 - 긍정적인 포유 동물 세포 listeriolysin O.이 효소를 생산 리스테리아 monocytogenes의 HlyA 유전자를 입력하는 자연 비침 투 박테리아를 허용 invasin을 인코딩 Yersinia의 pseudotuberculosis에서 인보이스 로커스을 가지고하면 치료 shRNA가에서 탈출하실 수 있습니다 항목은 대상 세포의 세포질 내에 vesicles. 여행 구조가 shRNAs의 T7 프로 모터 구동 합성에 필요한 T7 RNA 효소를 인코딩 능력 이외의 병원성 대장균 스트레인로 소개하고 있습니다. 다양한 RNAi 전략에 대해 잘 특징 암 관련 대상 분자가 ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp)입니다. 마약 압출 펌프 및 mediates의 "고전"ABCB1 - 중재 multidrug 저항 (MDR) 특정 교차 저항 패턴이 특징입니다 인간의 암 세포의 표현형으로 ABC - 전송 역할을합니다. 다른 ABCB1 - 표현 MDR 암 세포는 안티 - ABCB1 shRNA 벡터 표현 베어링 E. 취급했다 대장균. 이 절차는 암 세포 내에서 RNAi 경로의 활성화와 ABCB1 인코딩 mRNA의 상당한 아래 규정뿐만 아니라 해당 약품 압출 펌프 결과. 따라서, 약물 축적이 간직한 약물 모성 암 세포의 향상되었으며 MDR의 표현형이 반대했습니다. 이 모델에 의해 데이터가 TK RNAi 인간 암 세포에서 암 관련 요인, 예를 들어 ABCB1의 변조에 적합한 것을 증명 개념을 제공합니다.
Protocol
shRNAs 1) 세균성 배달
- 세균성 문화와 시작하기 전에, 하나는 LB - 미디엄과 LB - 한천을 준비한다.
- LB - 매체는 효모 추출물 (0.5 % W / V), bacto tryptone (1.0 % W / V) 및 NaCl (0.6 % W / V)을 무게와 아쿠아 bidest에서 이러한 구성 요소를 희석하십시오. 준비 솔루션은 압력솥에 소독을해야하고 사용할 수 있습니다.
- LB - 한천 플레이트에 대한 bacto 한천 (1.5 % W / V)은 살균 이전 LB - 매체에 추가되어야합니다.
- LB - 한천이 완전히 해산 때까지 전자 레인지에 LB - 한천을 가열. 병가 불에받지 않고 쉽게 감동 수있을 때까지 솔루션은 진정하자. 추가 단계에 긍정적인 클론의 선택에 대한 kanamycin을 (100 MG / ML) 추가합니다.
- 10 cm 페트리 - 요리로 LB - 한천 솔루션 20 ML을 pipetting하여 층류 벤치 (무균 조건)에 LB - 한천 플레이트를 준비합니다. 액체가 고체가 될 때까지 플레이트가 진정하자. 접시는 이제 사용할 수 있습니다 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- ShRNA 인코딩 표현 벡터는 관할 E.로 변환 아르 CaCl 2 프로 시저를 사용하여 열 충격에 의해 대장균 ceq221.
- 플레이트 100 μg / ML의 kanamycin이 포함된 LB - 한천 플레이트에 변형 박테리아가, 뚜껑을 닫으 parafilm으로 접시를 봉인하고 37 거꾸로 육성 ° 밤이여 C.
- 치아 선택과 성장 식민지를 채취하여 긍정적인 클론과 박테리아 미니 문화의 예방. 치아가 100 MG / ML kanamycin과 ° C 박 200 rpm으로 쉐이크에서 37 육성을 포함하는 신선한 LB - 매체의 7.0 ML로 선택 전송합니다.
- 100 ML의 예방 신선한 ° C 박 200 rpm으로 쉐이크에서 37여 밤 미니 1리터 Erlenmeyer 플라스크에 문화, 부화 100 MG / ML kanamycin 1:100이 포함된 LB - 중간.
- 시드 25 X 10 4, 6에서 잘마다 인간의 위장 암종 세포 (EPG85 - 257RDB) (씨앗을 품고 세포의 숫자에 따라 세포주의 세포 성장의 속도에 따라 달라집니다 confluency 24 시간 시딩 후 ~ 70-80%해야합니다) - 물론 요리와 37 이들을 품어 ° C, 밤 동안 5 % CO 2, 수증기 포화 분위기 인치
- 암 세포 감염으로 이전, TK RNAi 벡터가 포함된 E.의 밤 문화를 통해 대장균은 OD 600 결정하는 광도계로 측정하고 있습니다. 0.5의 광학 밀도까지 박테리아 솔루션을 희석하면 (OD 600 = 0.5 1.6 X 10 8 박테리아 세포 / ML와 동일)에 도달입니다.
- FCS없는 중간 공동 배양 세균 이전에 30 분 대한 암종 세포의 FCS 함유 세포 배양 매체를 교체합니다.
- 1 X PBS로 두 번 박테리아를 씻어하고, 혈청이없는 Leibovitz L - 15 중간에 희석.
- 37 암 원하는 뫄에서 세포 (암 세포 당 세균 세포의 감염의 다중성은 = 숫자)와 공동으로 품어 박테리아와 2 시간 동안 암세포에 희석 세균을 추가 ° C.
- 공동 배양 암세포 2 시간 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 2.5 μg / ML amphotericin, 150 μg /로 보충 혈청 함유 Leibovitz L - 15 중간과 함께 한 1X X PBS로 두 번 세탁하고 나서 ML gentamicin, 100 μg / ML의 kanamycin.
- 37 암 세포를 배양 ° C를 5 % CO 2, 수증기 포화 분위기에서 진행합니다.
- 세균성 치료의 효과는 mRNA 레벨에서 정량 실시간 RT PCR로 측정 형광 현미경, 의해와 단백질 수준에서 서부 얼룩 분석하여 시각 수 있으며, 외과 분석 및 세포 증식의 assays 같은 기능 assays로 표시하실 수 있습니다. (원한다면, 다음 절차가 자세히 설명되어 있습니다.)
2) 대표 결과
프로토콜이 올바르게 수행하면, 결과는 아래의 것들과 비교해야합니다.
형광 현미경
그림 1은 세 시간 박테리아 치료 후 인간의 위장 암종 세포를 (A) 치료 세포 (B)에 비해 보여줍니다. 취급 세포의 핵 주위, 박테리아 발견하실 수 있습니다.
그림 1 : 세균성 치료 (1:500) 후 형광 현미경 인간 위장 암종 세포와 치료 인간의 위장 암종 세포 제어로, DAPI - 얼룩, DAPI 밴드 필터 (Λem가 = 640 NM), 40x 목적.
정량 실시간 RT PCR
그림 2 약 70 %의 MDR1 mRNA의 아래 규정 (블랙 빔)은 치료 박테리아 치료 후 볼 수 있습니다. 부모 전지 MDR1 overexpression의 부족으로 인해 긍정적인 제어 역할을합니다. 257RDB p170가 포함된 셀 라인 플라스미드 백신 MDR1 shRNAs의 다른 R로 transkingdom RNAi 기술의 직접적인 비교로 찍은 표현나이는 전략을 입을. 치료 내성 세포주 EPG85 - 257RDB overexpressing MDR1, 플라스미드 표현 shRNA를 부족한 박테리아와 치료 같은 세포 라인이 세포주 플라스미드 표현을 방지 MRP2 shRNAs 들고 치료 박테리아 치료는 긍정적인 컨트롤로 이동되었습니다.
그림 2 : 치료 E. 치료 후 정량적 실시간 PCR RT MDR1 mRNA의 발현 안티 MDR1 shRNAs를 (500 뫄 1) 표현 대장균 ceq221. 정규화는 가사 유전자 aldolase를 사용하여 수행되었습니다. 세포주 EPG85 - 257RDB의 치료 세포의 MDR1/aldolase 비율 100 %를 설정했다. P - 값이 학생의 T - 테스트를 사용하여 계산되었다 (* = P <0.05, ** P = <0.005, ** P = <0.001).
서양 얼룩 분석
그림 3은 규제 아래 MDR1 또한 세균성 치료 후 단백질 수준에서 일어나는 보여줍니다. 그것은 약물에 민감한 부모 세포주 (EPG85 - 257P), 치료 약물 모성 세포주 (EPG85 - 257RDB)의 MDR1 표현과 처리 시료의 MDR1 표현의 부족 MDR1 표현을 보여줍니다. bacterially 취급 세포의 MDR1의 취소 규정은 아래로 볼 수 있습니다. 
그림 3 : 서양 얼룩 분석 치료 약물에 민감한 EPG85 - 257P의 MDR1 표현 수준, E. 공동 배양 후 치료 약물 모성 EPG - 257RDB 및 EPG85 - 257RDB니다. 대장균 ceq221 + p43 MDR1. 기본 AB C219 1:100, 및 안티 굴지 1시 5분 000, 보조 AB 방지 마우스 1시 10분 000.
세포 독성 분석
그림 4에 표시된 세포 독성 분석과 같은 기능 분석도 transkingdom RNAi의 기능에 대한 지표입니다. 부모의 세포 라인과 플라스미드 표현 anit - MDR1 shRNA를 포함하는 세포 라인은 daunorubicin 어떤 저항을 보여주지 않습니다. 내성 세포주 EPG85 - 257RDB 두 더욱 컨트롤 Daunorubicin에 대한 저항이 90 %로 되돌릴 수있는 백신 MDR1 shRNA 표현 박테리아로 처리 샘플에 비해 저항에 큰 변화를 표시하지 않습니다.
그림 4 : 세포 독성 분석. 의약품 특정 세포 생존에 대한 세포 독성 분석에 의해 결정 IC50 - 값. P - 값이 학생의 T - 테스트를 사용하여 계산되었다 (* = P <0.05, ** P = <0.005, ** P = <0.001).
Anthracycline 축적 분석
그림 5에서와 같이 bacterially 취급 샘플 낮춘 저항 (그림 4)에 의하면, 안티 MDR1 shRNA 취급 세포의 anthracycline 축적은 90 % 정도 증가합니다. 부모 세포주 및 세포주 257RDB p170은 100 %로 강한 daunorubicin 축적을 보여줍니다. 내성 변종은 거의 모든 축적을 보여줍니다 않습니다. 안티 MDR1 shRNA 표현 박테리아로 치료 세포는 90 %의 anthracyline 축적 증가를 보여줍니다.
그림 5 : Anthracycline 축적 분석. 육일 유동세포계측법으로 측정 박테리아 치료 후 암 세포의 Anthracycline의 축적. P - 값이 학생의 T - 테스트를 사용하여 계산되었다 (* = P <0.05, ** P = <0.005, ** P = <0.001).
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Discussion
휴대폰 번호는 감염 씨앗과 해당 뫄 사용되는, 비판적으로 세포 관찰하에 라인과 성장을 자신의 속도에 따라 달라집니다. 시딩을위한 최적의 휴대 전화 번호를 찾으려면, 사전 실험 성장의 속도를 결정하는 것이 좋습니다. 이 외에, 다른 MOIs는 세포가 스트레스 죽어없이 박테리아 침공 서있을 수있는 어떤 확장으로 인해 제한을 테스트해야합니다. 관찰에서 유전자의 아래 규정이 다를 수 있습니다 시간의 최적 가리 킵니다. 이것은 최적의 조건을 찾기 위해 특정 기간 동안 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 부여없이 지원했습니다. "Bundesministerium FÜR Forschung 놀이 Technologie (BMBF)의 01GU0615.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | No catalogue available, direct order | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | Contains 5,000 units of penicillin (base) and 5,000 μg of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline. | |
| Sodium chloride | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Tryptone | Difco Laboratories | 211705 | |
| Yeast Extract | Difco Laboratories | 212750 |
References
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