Summary
Die organoptypic Hippocampus Stück Kultur-Modell ist ein
Abstract
Organotypischen hippocampalen Slice-Kultur ist eine in vitro-Methode, um Mechanismen der neuronalen Verletzungen, in denen die grundlegende Architektur und die Zusammensetzung des Hippocampus relativ 1 ist erhalten zu untersuchen. Die organotypischen Kultur-System ermöglicht die Untersuchung der neuronalen, Astrozyten und Mikroglia-Effekte, sondern als Ex-vivo-Vorbereitung, befasst sich nicht mit Auswirkungen der Durchblutung, oder Rekrutierung von peripheren Entzündungszellen. Zu diesem Zweck ist diese Kultur-Methode häufig verwendet, um excitotoxic und hypoxischen Verletzung pyramidalen Neuronen des Hippocampus zu untersuchen, sondern wurde auch verwendet, um die entzündliche Reaktion zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Methoden zur Erzeugung von hippocampalen Slice-Kulturen aus postnatalen Nagetier Gehirn, Verwaltung toxische Reize zu neuronaler Schädigung hervorrufen, und Untersuchung und Quantifizierung des Hippocampus neuronalen Tod.
Protocol
1. Vorbereitung
Bevor Sie beginnen, montieren die erforderliche chirurgische Instrumente, Präparation und Kultur Medien und 7 Tage alten Ratte oder Maus Welpen. Das Protokoll ist das gleiche für Maus und Ratte Vorbereitungen.
(I) Material und Ausrüstung
- Operating Schere (gestreckte Länge 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro Präparierschere, (Länge 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Carbon Steel Dumont Pinzetten (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Geändert Glas "Transfer"-Pipetten (unten Pasteurpipette entfernt und Kanten geglättet)
- Aclar Plastikfolie geschnitten 2 "in x 2" in Quadrate (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
- Deckel Schwämme 4 in der 3 in (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
- 30 mm Millicell Membran-Einsätze (0,4 &mgr; m; Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain Tissue Chopper mit zweischneidiges Rasierklinge (McIlwain Gewebe Chopper, Vibratom Company, St. Louis, MO)
- Inversen Mikroskop mit CCD-Kamera und Bildanalyse-Software
(Ii) Dissection Medium (DM, 1 Liter bei pH 7,3)
| Hanks Balanced Salt | 1 Flasche (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 mM) | 350 mg |
| HEPES (10 mM) | 2,83 g |
| Glucose (33,3 mM) | 6,0 g |
| Penicillin / Streptomycin (100x) | 10 mL |
| BSA (0,3%) | 300 mg |
| MgSO 4-7H 2 O | 1,44 g |
(Iii) Kulturmedium (400 ml)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 mL |
| *** Hanks Balance-Salz (Invitrogen 24020-117) | 100 mL |
| Pferdeserum (Invitrogen 26050-070) | 100 mL |
| HEPES-Puffer (1 M; Invitrogen 15630-080) | 5 mL |
| Penicillin / Streptomycin (100x) | 4 mL |
| *** Fügen 12,8 g Glucose in 500 ml Hank Balance-Salz, bevor Kulturmedium | |
(Iv) Tiere
7 Tage alten Ratte oder Maus postnatal Welpen, in der Regel einen Wurf pro Experiment.
2. Am Tag der Kultur
- Alle Dissektion Werkzeuge und Aclar Film muss in 70% EtOH für 30 Minuten vor Beginn eingeweicht werden. Die Oberfläche der Dissektion Kapuze, Klinge und Gewebe Chopper muss mit Ethanol desinfiziert werden.
- Bereiten Sie mehrere (3-4) 6 well-Zellkulturplatten; 1 mL Kulturmedium pro Vertiefung, und legen Sie eine Millipore Membran in jede Vertiefung. Legen Sie 6-well Platten im 37 °-Inkubator bis zu seiner Scheiben übertragen.
- Bereiten Sie mehrere (4-6) 60 mm-Platten mit DM und auf Eis stellen.
- Schnell mit einer Schere zu enthaupten und tauchen Sie in 70% EtOH und schnell entlarven das Gehirn mit einem saggital Einschnitt des Schädels. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn und Ort sofort in kaltem DM. Separate es in zwei Hemisphären und Ort jeder Hemisphäre medialen Seite nach unten auf eine Abdeckung Schwamm für 2-3 Sekunden.
- Heben und Ort der Hemisphäre auf die Aclar Film Platz und auf dem Gewebe Chopper schneidet die Gehirn koronal in 350 um Abschnitte. Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie vorsichtig die Alcar Platz mit dem geschnittenen Hemisphäre und tauchen in kalten DM.
- Mit einem Binokular, scheiden sich die Hippocampus-Abschnitte. Für Ratten, sollte es 5 Sektionen Spanning rostral nach kaudal Hippocampus, und für die Maus sollte es 3-4 Abschnitte werden.
- Nehmen Sie die 6-well-Platten mit Membran-Einsätze aus dem 37 ° Gewebekultur-Inkubator. Transfer-Schnitten des Hippocampus einzeln auf die Membranen mit dem Glas Transferpipette. Wenn zu viel DM auf die Membran gelöst wird, entfernen überschüssige DM mit einer Pasteurpipette. Platz fünf Schnitten des Hippocampus auf jede Membran. Mindestens 3 Wells pro Zustand, oder 15 Scheiben schneiden.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° in einer 5% CO befeuchteten Inkubator für 12-14 Tage vor Beginn der Toxizität zu experimentieren. Das Kulturmedium kann zweimal pro Woche gewechselt werden.
3. Induktion und Quantifizierung Hippocampus neuronaler Schädigung in Scheiben Kultur
- Nach 12-14 Tagen in Kultur, mit 5 ug / ml Propidiumiodid (PI) zu den Kulturmedien. Dieser Schritt ermöglicht Visualisierung und Quantifizierung der basalen Zelltod.
- Am folgenden Tag, zu quantifizieren PIFluoreszenz in der CA1 Subregion (und / oder CA3 oder dentatus falls gewünscht) jedes Hippocampus Scheiben schneiden und zu erhalten bedeutet die PI-Fluoreszenz-Messungen darstellt basalen Zelltod (bezeichnet als Zeit = 0 Stunden oder T 0). Für die Bildaufnahme und Quantifizierung, verwenden wir OpenLab Software (Improvisation, UK), aber auch andere Bildaufnahme und Analyse-Software kann verwendet werden, um Fluoreszenz-Intensität zu quantifizieren.
- Unmittelbar nach der Bildaufnahme von T 0 PI Fluoreszenz induziert neuronale Verletzungen, die durch Ihre Methode der Wahl (wir haben 10 uM NMDA, Sauerstoff-Glukose Entzug oder LPS für eine Stunde gebraucht, um neuronale Toxizität 2,5 induzieren). Nach der toxischen Reiz, zu ersetzen durch frisches Medium mit 5 ug / ml PI und pflegen Scheiben über Nacht.
- Am Tag 3, zu quantifizieren bedeuten PI Fluoreszenz der experimentellen Bedingungen bei 24 oder T 24.
- Nach diesem Bildaufnahme, sofort ändern Medium und fügen 10 uM NMDA und 5 ug / ml PI und inkubieren Scheiben über Nacht bis zur maximalen neuronalen Tod zu erreichen.
- Am Tag 4, zu quantifizieren bedeuten PI Fluoreszenz von maximal neuronalen Tod, als T max definiert. Berechnen Prozent Zelltod wie folgt: (T 24 - T 0) / (T max-T 0).
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. (A) Time line zur Generierung von Hippocampus und anschließende experimentelle Verletzungen und Bildaufnahme. (B) Repräsentative Bilder Schnitten des Hippocampus basal (T 0), 24 Stunden nach einer 1-stündigen Exposition gegenüber 10 uM NMDA (T 24), und nach weiteren 24 Stunden oder 10 uM NMDA bis maximal neuronaler Schädigung (T max) zu erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es gibt zwei wichtige Punkte zu folgen, um reproduzierbare und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, wenn die Replikation Experimente. Zunächst ist es wichtig, den Schnitten des Hippocampus Alter für 12-14 Tage vor Experimentieren lassen. Mit slice Isolation, gibt es einen signifikanten Mikroglia Antwort, und Mikroglia noch einige Zeit aktiviert, mit einer Rückkehr zu einer ruhenden verzweigten Zustand auftretenden Tag 10 in vitro 3,6. Zweitens bedeuten PI Fluoreszenzintensität ist proportional zur Zahl der Verletzten Zellen 4. Sequential Fluoreszenz wird zu drei Zeitpunkten gemessen: (i) bei T 0, bevor NMDA oder OGD Stimulation basalen Ebenen des spontanen Absterben von Neuronen zu messen; (ii) bei T 24 oder 24 Stunden nach Stimulation mit NMDA oder OGD oder andere Anregung, und (iii) bei T max nach einer abschließenden Behandlung der Scheiben mit einer 24 Stunden über Nacht tödlichen Behandlung mit 10 uM NMDA, die die maximale Höhe der neuronalen Tod produziert. Der prozentuale Zelltod wird dann nach folgender Formel berechnet (T 24 - T 0) / (T max-T 0). Es ist wichtig, jede Scheibe, um sich zu normalisieren mit dieser Methode, da die Größe des Hippocampus und der Glutamat-Rezeptor-Expression und Verteilung wesentlich ändern, wie geht man von rostral nach kaudal Gehirn, und das Versäumnis, jede Scheibe, um sich zu normalisieren kann in artifactual Daten führen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Gefördert durch NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes
References
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
