Summary
organoptypic海馬スライス培養モデルは、
Abstract
器官海馬スライス培養では、海馬の基本的なアーキテクチャとコンポジションが相対的に1を保存されている神経細胞傷害のメカニズムを調べるためにin vitro法です。器官培養系は、神経細胞のアストロサイトやミクログリアの効果の検査は可能ですが、ex vivoでの準備として、血流、または末梢炎症性細胞の動員の影響には対応していません。そのために、この培養法は、頻繁に海馬の錐体ニューロンに興奮毒性と低酸素障害を調べるために使われるだけでなく、炎症反応を調べるために使用されています。ここで我々は、出生後の齧歯類の脳から海馬スライス培養を生成する神経細胞傷害を誘発する有毒な刺激を投与し、海馬神経細胞死を測定すると定量化するための方法を説明します。
Protocol
1。準備
開始する前に、必要な手術器具、解剖や文化、メディア、および7日齢のラットまたはマウスの仔を組み立てる。プロトコルは、マウスやラットの準備のための同じです。
（ⅰ）材料および機器
- 営業ハサミ（ストレート長さ6"、猫＃RS6818、Roboz、ゲイサーズバーグ、MD）
- Microは、ハサミ、解剖（長さ4'"、猫＃RS5910を。Roboz、ゲイサーズバーグ、MDは）
- 炭素鋼デュモンピンセット（猫＃RS - 5045.Roboz、ゲイサーズバーグ、MD）
- 改質ガラス"転送"ピペット（削除されたパスツールピペットの下部とエッジのスムージング）
- ACLARプラスチックフィルムが正方形で（ハネウェル、＃812071、ポッツビル、ペンシルバニア州）"× 2で"2にカット
- の3でのスポンジ4（ケンドール、猫＃3157、マンスフィールド、マサチューセッツ州）カバー
- 30ミリメートルMillicell膜インサート（0.4μmの、ミリポア、ベッドフォード、MA）
- 両刃のカミソリの刃を持つMcllwainのティッシュチョッパー（マッキルウェーン組織チョッパー、ビブラトーム社、セントルイス、MO）
- CCDカメラと画像解析ソフトウェアとの倒立顕微鏡
（ⅱ）解剖媒体（DM、pH7.3に1リットル）
| ハンクス平衡塩類 | 1バイアル（95.2 g/1L）（シグマ：H2387） |
| NHCO 3（4.2 mM）を | 350mgを |
| HEPES（10mM）を | 2.83グラム |
| グルコース（33.3 mM）を | 6.0グラム |
| ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） | 10mLの |
| BSA（0.3％） | 300mgの |
| し、MgSO 4 · 7H 2 O | 1.44グラム |
（ⅲ）培養培地（400 mL）に
| MEM（Invitrogen社11575〜032） | 200 mLの |
| ***ハンクのバランス塩（インビトロジェン24020〜117） | 100mLの |
| ウマ血清（Invitrogen社26050〜070） | 100mLの |
| HEPES緩衝液（1 M、インビトロジェン15630〜080） | 5 mLの |
| ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） | 4 mLの |
| ***培養液を加える前に、500mLのハンクのバランス塩に12.8グラムのブドウ糖を追加 | |
（IV）動物
7日齢ラットまたはマウスの出生後の仔、実験ごとに一般的には1リットル。
2。文化の日に
- すべての解剖ツールとACLARフィルムは開始前に30分間70％エタノールに浸漬する必要があります。解剖フード、ブレード、および組織のチョッパーの表面をエタノールで消毒する必要があります。
- ウェルあたり1mLの培養液を追加し、各ウェルのミリポア透過膜を挿入し、いくつかの（3-4）6ウェル組織培養プレートを準備します。場所、6ウェルのスライスを転送する準備が整うまで、37℃インキュベーターでプレート。
- DMと氷の上で場所を持ついくつかの（4-6）60 mmのプレートを準備します。
- 急速にはさみで首を切ると70％ETOHに浸し、そして迅速に頭蓋骨のsaggital切開と脳を公開。慎重に冷たいDMですぐに脳と場所を削除します。二つの半球に分離して2-3秒のカバーのスポンジに各半球内側を下に置きます。
- そっとティッシュチョッパーでACLARフィルムの正方形と場所の上に半球を持ち上げ、配置、350μmのセクションでcoronally脳をカット。終了したら、そっと冷たいDMの区分け半球と水没してAlcarの正方形を取る。
- 解剖顕微鏡を用いて、海馬切片を分離。ラットの場合は、尾側海馬への吻側またがる5つのセクションがあるはず、とマウスは3-4のセクションがあるはずです。
- 37℃組織培養インキュベーターから細胞膜を挿入した6ウェルプレートを取り出してください。ガラス転移のピペットを使用して透過性の膜の上に個別に海馬切片を移す。あまりにも多くのDMがメンブレン上に放出されている場合は、パスツールピペットでDM過剰を取り除く。それぞれの膜に5つの海馬スライスを置きます。条件ごとに少なくとも3ウェル、または15のスライスを許可する。
- 毒性の実験を開始する前に12-14日のために5％CO加湿インキュベーター中37℃で培養プレートをインキュベートする。培養液は週に2回変更することができます。
3。スライス培養における海馬神経損傷を誘発し、定量化
- 培養中の12-14日後、培養培地に5μg/ mLのヨウ化プロピジウム（PI）を追加します。このステップでは、基底細胞死の可視化と定量化が可能になります。
- 翌日、PIを定量化各海馬スライスのCA1サブリージョン（および/ またはCA3や歯状必要に応じて）の蛍光と取得は、基底細胞の死を（時間と呼ばれる= 0時間、またはT 0）を表すPI蛍光測定値を意味する。画像取得と定量化のために、我々は、オープンラボのソフトウェア（即興、英国）を使用しますが、他の画像取得と解析ソフトウェアは、蛍光強度を定量化するために使用することができます。
- すぐにT 0 PI蛍光の画像取得の後、ご入金方法（我々は神経毒性2,5を誘導するために一時間に10μMNMDA、酸素-グルコース欠乏、またはLPSを使用している）ことによって神経損傷を誘発する。毒性刺激後、5μg/ mLのPIを含む新しい培地と培地を交換して一晩のスライスを維持する。
- 3日目に、PI 24における実験条件の蛍光、またはT 24を意味し定量化する。
- この画像取得後、直ちに培地を変更し、10μMNMDAと5μg/ mLのPIと最大の神経細胞死を達成するために一晩インキュベートするスライスを追加します。
- 4日目に、T maxとして定義されている最大の神経細胞死のPIの蛍光を、意味し定量化する。次のようにパーセントの細胞死を計算します（T 24 - T 0）/（T MAX - T 0）。
4。代表的な結果
図1（）海馬と、その後の実験的な傷害と画像取得の世代のためのタイムライン。 （B）basally海馬スライスの代表画像（T 0）、24時間、10μMNMDA（T 24）に1時間暴露後の、そして最大の神経傷害を得るためにNMDAさらに24時間または10μM（T max）の後に。
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Discussion
実験を複製するときに再現性と一貫性のある結果を確保するために実行するには、2つの重要なポイントがあります。最初に、実験前に12-14日のために海馬スライスの年齢を聞かせすることが重要です。スライスの分離により、大幅なミクログリアの応答がある、とミクログリアをin vitroで 3,6 で 10日目で発生安静分岐し状態に戻ると、しばらくの間有効なまま。第二に、PIの蛍光強度が負傷したセルの番号4に比例することを意味。シーケンシャル蛍光は、3つの時点で測定される：（i）T 0において、NMDAまたは自発的な神経細胞死の基礎レベルを測定するためにOGD刺激前、（ⅱ）T 24、または24時間後のNMDAまたはOGDまたはその他の刺激による刺激後、および（iii）T maxで、神経細胞死の最大量を生産する、10μMNMDAによる24時間一晩致死治療とスライスの最後の治療に続く。 /（T MAX - T 0） -パーセントの細胞死は、その後、式を（T 0 T 24）を使用して計算されます。ため海馬の大きさとグルタミン酸受容体の発現と分布の変化が著しく一吻側から尾側脳に行く、そして自分自身に各スライスを正規化するために障害が人為的なデータに繋がる可能性があるので、それは、このメソッドを使用して自身に各スライスを正規化することが重要です。 。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
NINDS、米国心臓協会、老化研究のためのアメリカ連合、ダイムの月によって資金を供給
References
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
