Den Organotypic hippocampus Slice Kultur Modell för prövningen Neuronal skada

Summary

Den organoptypic hippocampus bit kultur-modellen är en

Abstract

Organotypic hippocampus bit kultur är ett in vitro-metod för att undersöka mekanismer för neuronal skada där den grundläggande strukturen och sammansättningen av hippocampus är relativt bevarade ^1. Det organotypic kulturen systemet tillåter för undersökning av neuronala, astrocytic och microglial effekter, utan som en ex vivo-förberedelser, inte tar upp effekterna av blodflöde, eller rekrytering av perifera inflammatoriska celler. I detta syfte är denna kultur metod som ofta används för att undersöka excitotoxic och hypoxiska skador pyramidformade nervceller i hippocampus, men har också använts för att undersöka det inflammatoriska svaret. Häri beskriver vi de metoder för att generera hippocampus skiva kulturer från födseln gnagare hjärnan, administrera giftiga stimuli för att framkalla neuronala skador, och testmetoder och kvantifiering av hippocampus neuronal död.

Protocol

1. Förberedelser

Innan du börjar, samla de nödvändiga kirurgiska instrument, dissektion och mediekultur, och 7 dagar gammal råtta eller ungar mus. Protokollet är densamma för mus och förberedelser råtta.

(I) Material och utrustning

• Rörelseresultatet sax (rak längd 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro dissekera sax, (längd 4 ", katt # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Kolstål Dumont pincett (katt # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Ändrad glas "transfer" pipetter (längst ned i pasteurpipett bort och kanter jämnas)
• Aclar plastfolie sänks till 2 "i x 2" på torg (Honeywell, # 812.071, Pottsville, PA)
• Täck svampar 4 i med 3 i (Kendall, katt # 3157, Mansfield, MA)
• 30 mm Millicell membran insatser (0,4 ìm, Millipore, Bedford, MA)
• Mcllwain Tissue chopper med tveeggat rakblad (McILwain vävnad helikopter, Vibratome Company, St Louis, MO)
• Inverterat mikroskop med CCD-kamera och bildanalys mjukvara

(Ii) Dissection Medium (DM, 1 liter vid pH 7,3)

Hanks Balanced Salt	1 injektionsflaska (95,2 g/1L) (Sigma: H2387)
NHCO 3 (4,2 mm)	350 mg
HEPES (10 mm)	2,83 g
Glukos (33,3 mm)	6,0 g
Penicillin / streptomycin (100x)	10 ml
BSA (0,3%)	300 mg
MgSO 4-7H 2 O	1,44 g

(Iii) Kultur medelstora (400 ml)

MEM (Invitrogen 11.575-032)	200 ml
*** Hank balans Salt (Invitrogen 24.020-117)	100 ml
Häst serum (Invitrogen 26.050-070)	100 ml
HEPES buffert (1 M, Invitrogen 15.630-080)	5 ml
Penicillin / streptomycin (100x)	4 mL
*** Lägg 12,8 g glukos till 500 ml Hanks Balance Salt innan odlingsmedium

(Iv) Djur

7 dagar gammal råtta eller mus postnatal ungar, vanligen en kull per försök.

2. På dagen för kultur

1. Alla dissektion verktyg och Aclar film måste blötläggas i 70% EtOH i 30 minuter innan du börjar. Ytan på dissektion huva, blad, och vävnad chopper måste desinficeras med etanol.
2. Förbered flera (3-4) 6 brunnar vävnadskultur, tillsätt 1 medelstor mL kultur per brunn, och sätt ett Millipore membran i varje brunn. Placera 6-brunnars plattor i 37 ° inkubatorn tills att överföra skivor.
3. Förbered flera (4-6) 60 mm plattor med DM och lägg på is.
4. Snabbt halshugga med sax och dopp i 70% EtOH och snabbt utsätta hjärnan med en saggital snitt i skallen. Ta försiktigt bort hjärnan och omedelbart i kallt DM. Separata den i två halvklot och placera varje halvklotet mediala sidan nedåt på en täcka svamp i 2-3 sekunder.
5. Lyft försiktigt och placera halvklotet på Aclar filmen torget och plats på vävnaden helikopter, skära hjärnan koronalt i 350 ìm avsnitt. När du är klar, ta varsamt Alcar torget med sektioneras halvklotet och dränka i kallt DM.
6. Med hjälp av en dissekera mikroskop skilja ut de hippocampus avsnitt. För råtta, bör det finnas fem avdelningar spänner rostralt till caudal hippocampus, och för mus bör det finnas 3-4 sektioner.
7. Ta ut 6-brunnars plattor med membran insatser från 37 ° vävnadsodling inkubator. Överför hippocampus skivor individuellt på genomsläppliga membran med hjälp av pipetten glaset överföringen. Om för mycket DM släpps ut på membranet, avlägsna överflödigt DM med en pasteurpipett. Placera fem hippocampus skivor på varje membran. Lämna minst 3 brunnar per tillstånd, eller 15 skivor.
8. Inkubera odlingsplattor vid 37 ° i en 5% CO fuktas inkubator för 12-14 dagar innan toxiciteten experimentet. Den odlingsmedium kan bytas två gånger i veckan.

3. Induktion och kvantifiera hippocampus Neuronal skada Slice Kultur

1. Efter 12-14 dagar i kultur, lägg till 5 mikrogram / ml propidiumjodid (PI) till kultur media. Detta steg kommer att möjliggöra visualisering och kvantifiering av basalcellscancer död.
2. Följande dag, kvantifiera PIfluorescens i CA1 subregionen (och / eller CA3 eller dentate om så önskas) för varje hippocampus skiva och få betyda PI fluorescensmätningar representerar basal celldöd (kallas tid = 0 timmar eller T _0). För bild förvärv och kvantifiering använder vi OpenLab programvara (Improvisation, Storbritannien), men andra bilden insamling och analys programvara kan användas för att kvantifiera fluorescensintensitet.
3. Omedelbart efter bild förvärvet av T ₀ PI fluorescens, framkalla neuronal skada genom ditt val av (vi har använt 10 mikroM NMDA, syre-glukos deprivation, eller LPS under en timme att förmå neuronala toxicitet ^2,5). Efter giftiga stimulans, byta medium med färska medium som innehåller 5 mikrogram / ml PI och underhålla skivor över natten.
4. Dag 3, kvantifiera menar PI fluorescens av de experimentella skick vid 24h, eller T _24.
5. Efter denna bild förvärvet omedelbart byta medium och tillsätt 10 mikroM NMDA och 5 mikrogram / ml PI och inkubera skivor över natten för att uppnå maximal neuronal död.
6. På dag 4, kvantifiera menar PI fluorescens maximal neuronal död, definierad som T _max. Beräkna döden procent cell enligt följande: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).}

4. Representativa resultat

Figur 1. (A) Tid linje för generering av hippocampus och efterföljande experimentella skador och bildtagning. (B) Representativa bilder av hippocampus skivor basally (t _0), 24 timmar efter 1 timmes exponering till 10 mikroM NMDA (T _24), och efter ytterligare 24 h eller 10 mikroM NMDA att få maximal neuronal skada (T _max).

Discussion

Det finns två viktiga punkter att följa för att säkerställa reproducerbara och konsekventa resultat vid replikering experiment. Först är det viktigt att låta hippocampus skivor ålder för 12-14 dagar innan försöket. Med bit isolering, det finns en betydande microglial svar och mikroglia förblir aktiverad under en tid, med en återgång till ett vilande förgrenad tillstånd som förekommer vid dag 10 in vitro ^3,6. För det andra menar PI fluorescensintensiteten är proportionell mot antalet skadade celler ^4. Sekventiell fluorescens mäts vid tre tidpunkter: (i) vid T _0, innan NMDA eller OGD stimulans för att mäta basala nivåer av spontana neuronal död, (ii) på T _24, eller 24 timmar efter stimulering med NMDA eller OGD eller annan stimulans, och (iii) vid T _max efter en slutlig behandling av skivor med en 24 timmars natten dödlig behandling med 10 mikroM NMDA som ger maximal mängd neuronala död. Andelen celldöd beräknas sedan med formeln (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max-T 0).} Det är viktigt att normalisera varje skiva för sig själv med denna metod eftersom storleken på hippocampus och glutamat receptorn uttryck och distribution förändras avsevärt när man går från rostralt till caudal hjärnan, och ett misslyckande att normalisera varje skiva för sig själv kan resultera i artefaktuella uppgifter .