Summary
Decellularized ऊतक से एक इंजेक्शन मैट्रिक्स जेल की तैयारी और यह चूहे मायोकार्डियम में इंजेक्शन के लिए तरीके
Abstract
इस प्रोटोकॉल दौरे ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक इंजेक्शन के बाह्य मैट्रिक्स जेल (ईसीएम) की तैयारी के लिए तरीके प्रदान करता है है. संक्षेप में, decellularized ऊतक lyophilized है, milled, enzymatically पच, और फिर शारीरिक पीएच के लिए लाया. lyophilization ऊतकों से सब पानी सामग्री को हटा, सूखी ECM है कि एक छोटे से मिल के साथ एक ठीक पाउडर में जमीन किया जा सकता है में जिसके परिणामस्वरूप. मिलिंग के बाद, ईसीएम पाउडर पेप्सिन साथ पच जाता है एक इंजेक्शन मैट्रिक्स फार्म करने के लिए. पीएच 7.4 करने के लिए समायोजन के बाद, तरल मैट्रिक्स सामग्री मायोकार्डियम में इंजेक्ट किया जा सकता है. पिछले लक्षण वर्णन assays के परिणाम से पता चला है कि मैट्रिक्स जैल decellularized pericardial और myocardial ऊतकों से उत्पादित विविध प्रोटीन, पेप्टाइड्स और glycosaminoglycans सहित देशी ECM घटकों, को बनाए रखने. ऊतक इंजीनियरिंग के लिए इस सामग्री के उपयोग को देखते हुए, vivo लक्षण वर्णन में विशेष रूप से उपयोगी है, यहाँ, बाएं निलय में एक अंदर का इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए एक विधि (LV) मुक्त दीवार मैट्रिक्स जेल में मेजबान प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के एक साधन के के रूप में प्रस्तुत किया है एक छोटे पशु मॉडल. सीने गह्वर में प्रवेश डायाफ्राम के माध्यम से प्राप्त की है और इंजेक्शन एल.वी. मुक्त दीवार में सुप्रीम से थोड़ा ऊपर किया जाता है. जैविक व्युत्पन्न पाड़ इंजेक्शन से पहले बायोटिन लेबलिंग के द्वारा visualized किया और फिर एक घोड़ा मूली peroxidase संयुग्मित neutravidin ऊतक वर्गों के साथ धुंधला हो जाना और diaminobenzidine धुंधला हो जाना (थपका) के माध्यम से visualizing कर सकते हैं. इंजेक्शन क्षेत्र के विश्लेषण भी histological और immunohistochemical धुंधला के साथ किया जा सकता है. इस तरह, पहले जांच pericardial और दौरे मैट्रिक्स जैल रेशेदार, झरझरा नेटवर्क फार्म और इंजेक्शन के क्षेत्र के भीतर वाहिनियों के गठन को बढ़ावा देने के दिखाया गया.
Protocol
1. पूर्व प्रसंस्करण ऊतक तैयार
- इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, एक पहले से ही पसंद के ऊतक decellularized चाहिए. इस उदाहरण के लिए, ताजा सुअर और मानव pericardium नमूने विआयनीकृत (डीआई) पानी और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में hypotonic और hypertonic rinses का उपयोग decellularized हैं.
- 24 घंटे के लिए विशेष रूप से, पहली बार डि पानी में 30 मिनट के लिए सुअर का पेरीकार्डियम धोने, तो 1% एसडीएस में लगातार फॉस्फेट में हलचल खारा (पीबीएस) buffered, एक 5 घंटे डि पानी से कुल्ला द्वारा पीछा किया. मानव pericardia के लिए, पहले 30 मिनट के लिए डि पानी में कुल्ला, तो एसडीएस पीबीएस में 1% में लगातार 60-65 घंटे के लिए हलचल, एक रात कुल्ला डि के द्वारा पीछा किया. सभी नमूनों को उनके अंतिम समाधान से निकालें और फिर डि 1 पानी चलाने के अंतर्गत कुल्ला .
- Decellularization को सत्यापित करने के लिए, एक छोटा सा टुकड़ा निकाल, ताजा यह अक्टूबर ठंड मध्यम में फ्रीज, और 10 सुक्ष्ममापी ऊतक वर्गों histological विश्लेषण के माध्यम से परीक्षा के लिए नमूना भर में हर 100 सुक्ष्ममापी ले, जैसा कि पहले 34-36 रिपोर्ट.
- नाभिक के अभाव के लिए ऊतक जांच hematoxylin और eosin दाग (एच एंड ई) का उपयोग करें. एक भी डीएनए के लिए एक फ्लोरोसेंट Hoescht 33342 दाग (1.0 μg / एमएल) का उपयोग एच एंड ई परिणाम को सत्यापित सकता है, संक्षेप में, अनुभागों ठीक है, rehydrate और पानी में कुल्ला, 10 मिनट के लिए दाग, और फिर अच्छी तरह कुल्ला और अंधेरे में दुकान. वैकल्पिक रूप से, एक Qiagen DNeasy रक्त और ऊतक किट है, जो एक नमूना की कुल डीएनए सामग्री यों के लिए डिज़ाइन किया गया है के रूप में एक ऐसी किट का उपयोग कर सकते हैं.
2. इंजेक्शन ईसीएम की तैयारी
- Lyophilization
- उचित तैयारी के बाद, तरल नाइट्रोजन के साथ या -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के द्वारा decellularized नमूने फ्रीज जब तक पूरी तरह से सूखे नमूने Lyophilize. अपने सिस्टम और अपने नमूने के पानी की सामग्री पर निर्भर करता है, यह कहीं भी 12 से 72 घंटे तक लग सकता है.
- पिसाई
- एक बार पूरी तरह से सूखे, एक विले मिनी मिल एक ठीक पाउडर में सूखे ECM पीसने के लिए प्रयोग किया जाता है. अपने उद्देश्यों के लिए उपयुक्त चलनी आकार चुनें, यहाँ, 40 गेज जाल प्रयोग किया जाता है. एक बार नमूने का बहुमत फिल्टर के माध्यम से आ गया है, milled ECM पाउडर के साथ संग्रह जार हटा दें. अगर वहाँ केवल एक छोटा सा नमूना है, नमूने के बाकी तरीकों की एक किस्म में मिल से निकाला जा सकता है, यहाँ एक क्यू - टिप मिल के स्थिर ब्लेड के पीछे अटक ECM निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- हमेशा यकीन है कि मिल स्वच्छ और मलबे से मुक्त है. यह भी महत्वपूर्ण है को यकीन है कि दोनों मिल और अपने नमूना पूरी तरह से सूख रहे हैं, किसी भी शेष नमी समग्र और पेड़ों का झुरमुट के लिए ECM साथ कारण सफल मिलिंग को रोकने. ECM ऊपर हवा से नमी ले सकते हैं और इसलिए सीधे lyophilizer से मिल के लिए जाना चाहिए.
- पाचन
- इंजेक्शन ECM फार्म, पाउडर पेप्सिन पचता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल Freyetes से संशोधित किया गया था, एट अल (2 ).
- यह महत्वपूर्ण है संभव के रूप में एक उत्पाद बाँझ के रूप में बनाए रखने के है, के रूप में यह vivo में इंजेक्ट किया जाएगा और संदूषण जटिलताओं के कारण हो सकता है. इस प्रकार, बाँझ शीशियों का उपयोग करें और चम्मच वजन और उपयोग करने से पहले सभी समाधान फिल्टर. मिलिंग के बाद और पाचन से पहले एक lyophilization कदम भी मदद बाँझपन बनाए रखना होगा.
- बाहर एक उपयुक्त जगमगाहट शीशी में ECM पाउडर के वांछित राशि का वजन. 1 एमएल तुलना में छोटे कुल मात्रा के लिए, यह सिफारिश की है आप एक 2 एमएल शीशी का उपयोग करें और बड़ी मात्रा के लिए, एक 20 एमएल शीशी. यह सुनिश्चित करता है कि प्रभावी ढंग से हलचल शीशी के तल में पर्याप्त तरल है.
- एक जगमगाहट शीशी में बाहर पेप्सिन के वांछित राशि का वजन. 0.1 एम जैसे कि पेप्सिन 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में एचसीएल जोड़ें. सुनिश्चित करें पेप्सिन पूरी तरह भंग कर रहा है (नहीं particulates) से पहले का उपयोग इस पेप्सिन समाधान vortexing द्वारा तेजी से हो सकता है.
- / पेप्सिन एचसीएल ECM पाउडर के साथ जगमगाहट शीशी के लिए समाधान है ताकि ECM 10 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में जोड़ें.
- समाधान लगातार 60-65 घंटे के लिए, हिलाओ समय - समय पर नीचे एक चम्मच वजन या रंग के साथ शीशी के पक्ष scraping.
- पीएच समायोजन
- इस कदम के लिए शारीरिक पीएच तरल मैट्रिक्स सामग्री लाने और पेप्सिन निष्क्रिय, यह ECM आगे cleaving से रखने के लिए किया जाता है. फिर, के लिए फ़िल्टर Millipore पानी के साथ बनाया समाधान का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो.
- 1 एम NaOH 1 / मूल मात्रा 10 से जोड़ा जाता है. इस बिंदु पर पीएच टेस्ट जोड़ने और NaOH या ऐसे एचसीएल की छोटी मात्रा में है कि (20-10 μl) वांछित पीएच (7.4) तक पहुँच जाता है. सभी छोटे निराकरण के लिए जोड़ा या पीएच परीक्षण के लिए हटा दिया मात्रा का ट्रैक रखें. एक बार समाधान निष्प्रभावी किया गया है, 10x पीबीएस / 1 10 अंतिम मात्रा (1 / 9 वर्तमान मात्रा) जोड़ें. इंजेक्शन ईसीएम की एकाग्रता का निर्धारण और फिर 1x पीबीएस जोड़ने के लिए वांछित अंतिम सह तक पहुंचncentration, यहाँ 6 मिलीग्राम / एमएल.
- इंजेक्शन ईसीएम की विशेषता एसडीएस पृष्ठ Blyscan वर्णमिति भूमिकाः परख, और जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से किया जा सकता है.
- इस बिंदु पर, मैट्रिक्स सामग्री vivo में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है है दौरे ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक पाड़ फार्म.
- बायोटिन - लेबल
- ईसीएम इंजेक्शन ईसीएम की आसान दृश्य के लिए इंजेक्शन पहले बायोटिन के साथ टैग किया जा सकता है.
- बायोटिन की एक 10mm समाधान तैयार और 0.3mg/mg के अनुपात में इंजेक्शन ECM के लिए जोड़ें. ECM इंजेक्शन के लिए वांछित एकाग्रता में होना चाहिए. यदि 6 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता में इंजेक्शन, ईसीएम के 1 एमएल प्रति 40 μL बायोटिन जोड़ें. इंजेक्शन के लिए पहले, कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर बायोटिन-ECM समाधान रखना.
- सभी प्रसंस्करण कदम कमरे के तापमान पर किया जा सकता है. बीच बढ़िया तालमेल से इंजेक्शन मैट्रिक्स रखने के लिए, पीएच समायोजन कदम बर्फ पर किया जा सकता है.
3. Myocardial इंजेक्शन
- इंजेक्शन तैयारी
- मादा चूहों (225-250 ग्राम) यहां इस्तेमाल किया, पीएच 7.4 इंजेक्शन ईसीएम के 75 μL इंजेक्शन 0.1 एमएल 30 गेज सुई के साथ इत्तला दे दी सीरिंज में तैयार थे. यदि नर चूहों (375-400 ग्राम) का इस्तेमाल किया गया, 90 μL इंजेक्शन जा सकता है.
- सभी शल्य चिकित्सा की आपूर्ति सर्जरी से पहले निष्फल होना चाहिए, यहाँ हम एक autoclaved शल्य चिकित्सा पैक का उपयोग करें कि सभी आवश्यक उपकरण शामिल है.
- सर्जरी के दिन, एक Harlan Sprague-Dawley चूहे anesthetized 5% से कम isoflurane का उपयोग, एक ओटोस्काप का उपयोग कर intubated, और तब प्रक्रिया के दौरान 2.5 isoflurane% पर बनाए रखा.
- जानवर की आँखों कृत्रिम आँसू मरहम जोड़ें सूखापन और बाल के खिलाफ की रक्षा. जलयोजन के लिए सर्जरी के दौरान lactated Ringers समाधान के 3 एमएल प्रशासन. यह निचले उदर क्षेत्र में उपचर्म इंजेक्शन के माध्यम से किया जाना चाहिए.
- लापरवाह स्थिति में पशु शल्य चिकित्सा और अंगों के नीचे धीरे टेप मेज पर रखें. क़ैंची का प्रयोग करें पेट और वैक्यूम मुक्त scrubbing के लिए पहले बालों पर बालों को हटाने.
- 2% (लगभग 50 μL प्रत्येक) के छोटे इंजेक्शन की एक श्रृंखला बनाओ एक विकर्ण के साथ zyphoid प्रक्रिया से पेट के निचले हिस्से के दाईं ओर lidocaine. फिर betadine साथ तीन बार साफ़, बीच में शुरू और जावक चलती. 70% इथेनॉल के साथ दोहराएँ. एक पूर्व बनाया परिपत्र खिड़की के साथ एक शल्य टांगना का उपयोग पशु कवर, तौलिया clamps के साथ सुरक्षित, यदि आवश्यक है.
- एक सं 10 स्केलपेल एक 3-4 सेमी xyphoid प्रक्रिया से पेट के निचले हिस्से के दाईं ओर को चीरा बनाने का उपयोग करना. Xyphoid प्रक्रिया का पता लगाएँ और मांसपेशियों के माध्यम से खड़ी नीचे सही करने के लिए काटना, सही पर बड़े पोत से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है. एक बार जब आप मांसपेशियों के माध्यम से dissected है, कैंची का उपयोग मांसपेशियों के माध्यम से कटौती laterally, डायाफ्राम उजागर. करने के लिए जिगर से बचने के लिए सावधान रहें.
- Zyphoid प्रक्रिया के माध्यम से 3-0 Vicrile सीवन के एक 36 इंच की लंबाई और hemostats की एक जोड़ी, ड्राइव एक सुई का प्रयोग और सिवनी खींच माध्यम से आधे रास्ते. टेप सीवन के साथ समाप्त होता है और ऊपर और जानवर के पीछे अनिवार्य रूप से zyphoid उठाने और डायाफ्राम उजागर एक बिंदु के लिए ठीक है. अगले 3-0 Vicrile सिवनी की 36 इंच की लंबाई के साथ, xyphoid प्रक्रिया को निकटतम मांसपेशियों के माध्यम से एक सुई ड्राइव और, फिर से, के माध्यम से खींचने के लिए और समाप्त होता है एक और बात करने के लिए शल्य तालिका के दाईं ओर ठीक है, पूरी तरह से शल्य चिकित्सा गुहा को उजागर.
- इस बिंदु पर, आप डायाफ्राम के माध्यम से दिल को देखने के लिए सक्षम होना चाहिए. चूहे दांत microforceps के एक छोटे से जोड़ी का प्रयोग, डायाफ्राम के केंद्र ले लो, यह आप की ओर बाहर खींच और कुंद कैंची के साथ एक बहुत छोटा सा चीरा बनाते हैं. यह अत्यंत महत्वपूर्ण है बहुत कुंद कैंची का उपयोग क्रम में फेफड़ों poking से बचने के. एक बार इस छेद किया गया है, फेफड़ों को वापस लेना, तुम एक 2-3 सेमी चीरा बनाने के लिए खड़ी डायाफ्राम के माध्यम से दिल की कल्पना की अनुमति होगी.
- गुहा के बाईं ओर एक 3 इंच क्यू की नोक सम्मिलित फेफड़ों के रास्ते से बाहर धक्का. एक तौलिया दबाना का प्रयोग करने के लिए सुरक्षित जगह में क्यू - टिप. सही फेफड़ों के रास्ते से बाहर कदम क्रम में pericardial थैली का पता लगाने की एक और क्यू - टिप का उपयोग करें. Microforceps और बड़े दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी की एक जोड़ी का प्रयोग, pericardial थैली के माध्यम से आंसू, दिल के शीर्ष उजागर. यदि पशु पहले एक रोधगलन प्रक्रिया से गुजरा है, pericardium पहले से ही अनुपस्थित हो जाएगा.
- चूहे दांत microforceps के साथ दिल के शीर्ष पकड़ो और तरल मैट्रिक्स सामग्री सुप्रीम से रास्ते से एक तिहाई इंजेक्षन. Epicardial सतह सुई समानांतर डालें और बाईं सुई के beveled बढ़त के साथ इंजेक्षन. महान हृदय नस से बचने के लिए सुनिश्चित करें. सुई को हटाने से पहले एक कुछ सेकंड रुको. आप ऊतक के एक whitening इंजेक्शन के स्थल पर देखना चाहिए.
- गुहा में रक्त स्वच्छ और तौलिया दबाना और क्यू - टिप है कि सही फेफड़ों के पकड़े हुए था हटायें. घुमावदार microhemostats और चूहे का प्रयोग करेंदाँत के लिए डायाफ्राम बंद microforceps है. एक प्रारंभिक गाँठ बनाओ और तब दाँतेदार संदंश और microhemostats का उपयोग करने के लिए एक सतत सिवनी और एक पतला सुई के साथ डायाफ्राम बंद. पूरी तरह से बंद करने से पहले, PE160 चूषण टयूबिंग डालें और एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए छाती गुहा खाली के रूप में सिवनी कड़ा है.
- जब ठीक से खाली है और बंद, डायाफ्राम अवतल होना चाहिए. एक उत्तल डायाफ्राम इंगित करता है कि वहाँ अभी भी गुहा में हवा है.
- इस बिंदु पर isoflurane 1% करने के लिए ठुकरा दिया जा सकता है.
- दोनों 3-0 Vicrile पकड़े है गुहा खोलने के sutures के बाहर ले लो. मांसपेशियों हाइड्रेट बाँझ पानी का प्रयोग करें, अतिरिक्त एक क्यू की नोक या बाँझ धुंध के साथ दूर पोंछते. 3-0 सीवन के एक नए लंबाई का उपयोग करने के लिए आंतरायिक sutures के साथ मांसपेशी परत बंद.
- इस बिंदु पर, isoflurane बंद किया जा सकता है.
- बाँझ पानी और उपयोग करने के लिए त्वचा बंद स्टेपल के साथ स्वच्छ क्षेत्र. यदि स्टेपल अध्ययन के साथ हस्तक्षेप करेगा, 5-0 प्रोलाइन सिवनी भी इस्तेमाल किया जा सकता है. उस मामले में, एक रिवर्स काटने सुई (आर सी) का उपयोग करने के लिए आंतरायिक sutures के साथ त्वचा बंद. दोनों ही मामलों में, बंद चीरा शल्य गोंद हाजिर.
- एक क्यू की नोक का प्रयोग एक ट्रिपल एंटीबायोटिक मरहम के साथ चीरा साइट अभिषेक.
- जानवरों की 100% ऑक्सीजन के तहत ठीक करने के लिए अनुमति दें.
- जब पशु वेंटीलेटर आसपास साँस लेने के लिए शुरू होता है, ट्रेकिआ ट्यूब हटा दें.
- एक बार जानवरों sternal हैं, 0.05 मिलीग्राम / किलो buprenorphine हाइड्रोक्लोराइड की एक उपचर्म इंजेक्शन प्रशासन और उन्हें उनके घर के पिंजरे में एक बाँझ तौलिया पर वापसी.
- जानवरों पोस्ट ऑपरेटिव निगरानी और देखभाल प्राप्त करना चाहिए.
- ब्याज की समय बिंदुओं पर, जानवरों और euthanized हैं दिल विश्लेषण के लिए हटा दिया है. लघु अक्ष पार वर्गों लिया और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ सकल ऊतक के विश्लेषण के लिए दाग जा सकता है. थोड़े समय के अंक में, इंजेक्शन क्षेत्र एक गुलाबी, रेशेदार नेटवर्क फैल गया है कि interstitially के रूप में दिखाई देगा. बाद में समय बिंदुओं पर, एक कोशिकाओं की एक बाढ़ और 2 से 3 सप्ताह के बाद इंजेक्शन मैट्रिक्स अंततः गिरावट का पालन करेंगे. यदि ECM बायोटिन के साथ इंजेक्शन लगाने से पहले चिह्नित किया गया, यह अधिक सीधे एचआरपी संयुग्मित streptavidin के साथ बायोटिन धुंधला द्वारा visualized किया जा सकता है. Immunohistochemical धुंधला हो जाना करने के लिए इंजेक्शन के क्षेत्र में विशिष्ट संरचनाओं या कक्षों की पहचान करने के लिए, यहाँ स्लाइड्स किया गया है FITC संयुग्मित isolectin है कि एक Alexafluor माध्यमिक के साथ endothelial कोशिकाओं और fluoresces हरे और एक विरोधी चिकनी मांसपेशियों actin एंटीबॉडी बांध के साथ सह दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एंटीबॉडी कि लाल रंग में SMCs रिपोर्ट है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
मैट्रिक्स इस तरह से तैयार सामग्री का पिछला लक्षण वर्णन अणुओं की एक किस्म की अवधारण का प्रदर्शन किया. विशेष रूप से, एकाधिक रेशेदार प्रोटीन और glycoproteins मास स्पेक्ट्रोमेट्री (तालिका 1) के माध्यम से पहचान की गई. अगर मैट्रिक्स इस प्रोटोकॉल के अनुसार प्रसंस्कृत सामग्री नहीं रह अणुओं की एक जटिल सरणी शामिल पाए जाते हैं, यह हो सकता है कि decellularization कार्यरत प्रोटोकॉल भी कठोर है. सूखे pericardial ईसीएम, एक बार पूरी तरह lyophilized बहुत कठोर, crumpled कागज की तरह लग रहा है. अन्य प्रकार के ऊतकों मूँगफली पैकिंग समान होगा. यदि अच्छी तरह से milled, ECM चलनी के माध्यम से आते हैं और तल पर जार में एकत्र होना चाहिए. अगर वहाँ नमी नमूने में छोड़ दिया है, ECM पेड़ों का झुरमुट एक साथ करेंगे और मिलिंग कक्ष में फंस. पाचन के बाद, ECM समाधान एक दूधिया रंग और पूरी तरह से दिखाई particulates से मुक्त होना चाहिए. यह भी थोड़ा अधिक एचसीएल अकेले की तुलना में चिपचिपा हो जाएगा. यदि ECM अच्छी तरह से पचा नहीं करता है, वहाँ अभी भी शीशी में बड़ी particulates जाएगा, वैकल्पिक रूप से, ECM समाधान के क्रैश हो सकता है. पीएच समायोजन के बाद, वहाँ समाधान में नहीं दिखाई परिवर्तन है, और ECM अभी भी एक बादल, सजातीय तरल है. यदि यह जेल करने के लिए शुरू होता है, दलदलापन बढ़ाने के लिए और यह मुश्किल या असंभव हो एक सिरिंज में सामग्री को आकर्षित करेगा. यदि ऐसा होता है, पूर्व ठंडा समाधान के साथ बर्फ पर पीएच समायोजन कदम प्रदर्शन करते हैं. एक बार इंजेक्शन तैयार किया गया है, उन्हें उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं. यदि इंजेक्शन सफल रहा है, सुई की नोक के आसपास क्षेत्र whitens है और एक छोटे से सांस में दिखाई देता है. यदि यह नहीं देखा है, इंजेक्शन कक्ष में के बजाय दीवार में चला गया हो सकता है. जब इंजेक्शन के बाद पशु suturing, डायाफ्राम के सावधान समापन सबसे महत्वपूर्ण कदम है. यदि सही ढंग से किया, डायाफ्राम फेफड़ों के खिलाफ तंग हो और अवतल दिखाई देगा होगा. अगर वहाँ किसी भी हवा फेफड़ों के अंदर छोड़ दिया है, डायाफ्राम उत्तल रहते हैं, या एक क्षेत्र है जहां यह बाहर गुब्बारे है. जब एक प्रारंभिक समय बिंदु (4 घंटे के बाद इंजेक्शन 30 मिनट) पर इंजेक्शन क्षेत्र के ऊतक विज्ञान की जांच, एक गुलाबी, रेशेदार क्षेत्र में है कि कोशिकाओं से रहित है यह reassembled मैट्रिक्स सामग्री के बाद इंजेक्शन (चित्रा 2) है देखना चाहिए . नेटवर्क अक्सर interstitially से फैलता है और कई वर्गों में मौजूद हो सकता है. एक possकेवल मैट्रिक्स जेल के एक बहुत छोटे से क्षेत्र को देखने के लिए ible विवरण है कि इंजेक्शन के एक हिस्से के अंदर लक्ष्य चूक गए और या तो एल.वी. कक्ष में इंजेक्शन या इंजेक्शन के स्थान से बाहर लीक. इसके अतिरिक्त, जमाना समय पर निर्भर करता है, बीचवाला प्रसार भिन्न हो सकते हैं.
चित्रा 1 polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम (पृष्ठ).. (ए) आण्विक वजन मानक. (बी) चूहा पूंछ कोलेजन प्रकार solubilized (सी) मानव और सुअर का (डी) pericardial ईसीएम (7 मिलीग्राम / एमएल) की तुलना में मैं (2.5 मिलीग्राम / एमएल). नोट: कोलेजन की उपस्थिति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से pericardial मैट्रिक्स नमूनों में कई अन्य प्रोटीन और पेप्टाइड्स.
तालिका 1. ECM घटकों जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ की पहचान की.
चित्रा 2 Myocardial इंजेक्शन: vivo जमाना में. एच एंड ई (ए) मानव और सुअर के दाग (बी) pericardial मैट्रिक्स इंजेक्शन है कि vivo में 45 मिनट के बाद gelled है . तीर मैट्रिक्स स्थान, दाग हल्का गुलाबी मायोकार्डियम की तुलना निरूपित. स्केल बार 500 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 3 संवहनी सेल घुसपैठ. इंजेक्शन मानव (एसी) और सुअर का (लोमो) दो सप्ताह में मैट्रिक्स जैल में जहाजों के लिए प्रतिदीप्त दाग. Endothelial कोशिकाओं हरे (ए, डी) में चिह्नित कर रहे हैं, जबकि चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं लाल (बी, ई) में चिह्नित कर रहे हैं. विलय छवियों सी में दिखाए जाते हैं और एफ स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी है. सफेद बिंदीदार लाइनों मैट्रिक्स इंजेक्शन के क्षेत्र में, एच एंड ई पास के एक खंड के विश्लेषण द्वारा निर्धारित रूप में संकेत मिलता है.
चित्रा 4 मैट्रिक्स इंजेक्शन क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं को स्टेम . एक Hoescht नाभिक के लिए दाग (नीला) और सी किट (हरा) (ए) मानव और सुअर का (बी) मैट्रिक्स इंजेक्शन क्षेत्रों में स्टेम सेल की पहचान है. स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी है.
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Discussion
इस विधि जैविक व्युत्पन्न दौरे ऊतक इंजीनियरिंग के लिए, इंजेक्शन scaffolds की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. हालांकि इन तरीकों के शुरू में निर्माण के लिए विकसित किए गए और एक myocardial मैट्रिक्स जेल और एक pericardial मैट्रिक्स जेल साथ यहाँ प्रस्तुत के vivo परीक्षण में, इस प्रोटोकॉल किसी भी ऊतक के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, ऊतक उचित decellularized किया जा सकता है. Decellularization और प्रदर्शन किया जाना चाहिए और इन तरीकों का उपयोग करने से पहले सत्यापित, मैट्रिक्स जेल में डीएनए की उपस्थिति के रूप में एक अवांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का कारण सकता है. वहाँ तरीके के लिए सामग्री decellularize की एक किस्म है, और कई अच्छी समीक्षाएँ विषय 3, 4 पर लिखा गया है.
जब एक मैट्रिक्स जेल की तैयारी, यह जरूरी है कि नमूना पूरी तरह से lyophilized है, के रूप में किसी भी शेष नमी मिलिंग रोकने जाएगा. इसके अलावा, ECM पाउडर की साँस लेना से बचने के लिए, हमेशा एक चेहरा मुखौटा पहन जब मिलिंग. अंत में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जब मैट्रिक्स जेल vivo अध्ययन में एक के लिए इरादा है, तैयारी में संभव के रूप में एक तरह से बाँझ के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में संदूषण है कि संक्रमण के लिए नेतृत्व सकता है के जोखिम को कम है. यदि एक अलग ऊतक प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित, कुछ मापदंडों को अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. उदाहरण के लिए, एक ईसीएम की एकाग्रता कुछ ऊतकों के एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता कम सांद्रता में एक जेल और कुछ हो सकता है जेल के रूप में बदल सकता है. इसके अतिरिक्त, आवश्यक पाचन समय और पेप्सिन एकाग्रता अगर इस्तेमाल किया पेप्सिन की ताकत काफी अलग है भिन्न हो सकते हैं.
छोटे जानवर सर्जरी मॉडल इस प्रोटोकॉल में वर्णित एल.वी. मुक्त दीवार में स्वस्थानी gelling सामग्री में किसी के इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जा सकता है. दिल में सेल आधारित ऊतक इंजीनियरिंग उपचार की जांच करने के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए कोशिकाओं का एक संयोजन और इन biologically व्युत्पन्न जैल इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, इन तरीकों की तैयारी के लिए और दौरे ऊतक इंजीनियरिंग के लिए जैविक व्युत्पन्न जैल के vivo विशेषताओं में एक लचीला रूपरेखा प्रदान करते हैं.
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Disclosures
पशु प्रयोग करें: इस अध्ययन में सभी प्रयोगों संस्थागत पशु देखभाल और विश्वविद्यालय में कैलिफोर्निया, सैन डिएगो और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन के उपयोग समिति द्वारा प्रकाशित दिशा - निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस शोध में भाग एनआईएच के निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार कार्यक्रम, अनुदान संख्या 1-DP2 - OD004309-01 के माध्यम से चिकित्सा अनुसंधान के लिए NIH रोडमैप का हिस्सा है, द्वारा समर्थित किया गया था. SBS-एन. एक ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप के लिए NSF का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized |
| Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Equipment: | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Labconco Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Surgical supplies: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Lactated Ringers Solution | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaine, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Artificial tear ointment | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Triple antibiotic ointment | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscope | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Stop cock | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| 3-0 Vicrile suture | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| 5-0 Proline suture | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| PE160 suction tubing | BD Biosciences | 427430 | |
| Clippers | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Skin staples/stapler | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| General supplies: | |||
| Stir plates | |||
| 0.1 M HCl | |||
| 1 M NaOH | |||
| 10x PBS | |||
| 1x PBS | |||
| 70% Ethanol | |||
| 0.1 mL syringes | |||
| 10 mL syringe | |||
| Q-tips | |||
| Surgical glue | |||
| Surgical drape | |||
| Towel clamps | |||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).
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- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
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- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
