Summary
Metoder för att förbereda ett injicerbart matris gel från decellularized vävnad och injiceras i råtta hjärtmuskeln
Abstract
Detta protokoll innehåller metoder för beredning av ett injicerbart extracellulärt matrix (ECM) gel för hjärtinfarkt applikationer tissue engineering. Kortfattat är decellularized vävnad frystorkad, malts, enzymatiskt smälta, och sedan tagit till fysiologiska pH. Den frystorkning tar bort allt vatten innehåll från vävnaden, vilket resulterar i torra ECM som kan malas till ett fint pulver med en liten kvarn. Efter fräsning är ECM pulvret kokas med pepsin för att bilda en injicerbara matris. Efter justering till pH 7,4, kan det flytande matrisen materialet sprutas in i hjärtmuskeln. Resultat av tidigare karakterisering analyser har visat att matrisen geler produceras från decellularized perikardiell och hjärtinfarkt vävnad behålla infödda ECM-komponenter, inklusive olika proteiner, peptider och glykosaminoglykaner. Eftersom användningen av detta material för tissue engineering, in vivo karakterisering är särskilt användbart, här, (LV) en metod för att utföra en intramural injektion i vänster kammare fri vägg presenteras som ett sätt att analysera värd reaktion på matrisen gelen i ett litet djur modell. Tillgång till brösthålan erhålls genom membranet och injektionen görs något över apex i LV fria väggen. Den biologiskt härledda schavotten kan visualiseras genom biotin-märkning före injektion och sedan färgning vävnadssnitt med pepparrot peroxidaskonjugerade neutravidin och visualisera via Diaminobenzidin (DAB) färgning. Analys av injektionen regionen kan också göras med histologiska och immunhistokemisk färgning. På detta sätt var de tidigare undersökt perikardiell och hjärtinfarkt matris geler visat att bilda fibrer, porösa nätverk och främja kärlnybildning inom injektionen regionen.
Protocol
1. Förbehandling Tissue Förberedelser
- Innan du använder detta protokoll måste en redan decellularized vävnaden val. I det här exemplet är fräscha svin och humanprov hjärtsäck decellularized med hypoton och hyperton sköljningar i avjoniserat (DI) vatten och natriumdodecylsulfat (SDS).
- Närmare bestämt, först tvätta svin hjärtsäck i DI vatten i 30 minuter, rör kontinuerligt i 1% SDS i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 24 timmar, följt av en 5 timmars DI-vatten skölja. För mänskliga pericardia, skölj i DI vatten i 30 minuter, rör kontinuerligt i 1% SDS i PBS för 60-65 timmar, följt av en övernattning DI skölj. Ta bort alla prover från deras slutliga lösningen och skölj igen under rinnande DI-vatten 1.
- För att verifiera decellularization, ta bort en liten bit, färsk frysa den i oktober frysa medium och tar 10 mikrometer vävnadssnitt varje 100 ìm hela provet för undersökning via histologisk analys, som tidigare rapporterats 34-36.
- Använd hematoxylin och eosin (H & E) fläckar att undersöka vävnad för frånvaron av atomkärnor. Man kan också använda en fluorescerande Hoescht 33.342 fläcken (1,0 mikrogram / ml) för DNA för att verifiera H & resultat E, kort, fixa avsnitten, rehydrera och skölj i vatten, bets i 10 minuter och skölj sedan väl och förvara i mörker. Alternativt kan man använda ett kit som Qiagen DNeasy blod och vävnad kit, som är utformad för att kvantifiera det totala DNA-innehållet i ett prov.
2. Beredning av injicerbara ECM
- Frystorkning
- Efter lämplig beredning, frysa decellularized prover med flytande kväve eller genom att förvara vid -80 ° C. Lyophilize proverna tills den är helt torr. Beroende på ditt system och vatteninnehåll i dina prover, kan det ta allt från 12 till 72 timmar.
- Fräsning
- När helt torr, är en Wiley Mini Mill används för att slipa den torra ECM till ett fint pulver. Välj lämplig siktstorlek för dina ändamål, här är 40 gauge nät används. När majoriteten av provet har kommit igenom filtret, ta bort samlingen burken med frästa ECM pulver. Om det bara finns ett litet urval, kan resten av provet extraheras från bruket i en mängd olika sätt, här är en tops som används för att ta bort ECM fastnat bakom den stationära blad bruket.
- Se alltid till att fabriken är rent och fritt från skräp. Det är också viktigt att se till att både bruket och ditt prov är helt torra, eventuell kvarvarande fukt gör att ECM att aggregera och klumpa ihop sig, förebygga framgångsrika fräsning. ECM kan ta upp fukt från luften och så bör gå direkt från frystorkning till bruket.
- Matsmältning
- Att bilda den injicerbara ECM är pulvret rötas pepsin. Följande protokoll ändrades från Freyetes, et al. (2).
- Det är viktigt att upprätthålla en så steril en produkt som möjligt, eftersom det kommer att injiceras in vivo och föroreningar kan orsaka komplikationer. Därför använder sterila injektionsflaskor och väger skedar och filtrera alla lösningar innan användning. En frystorkning steg efter fräsning och innan matsmältningen kommer också att bidra till att upprätthålla sterilitet.
- Väg upp önskad mängd ECM-pulver i en lämplig scintillation flaskan. För total volym mindre än 1 ml, rekommenderas du använda en 2 ml injektionsflaska och för större volymer, en 20 ml injektionsflaska. Detta säkerställer att det finns tillräckligt med vätska i botten av flaskan att röra effektivt.
- Väg upp önskad mängd pepsin i en scintillation flaska. Tillsätt 0,1 M HCl så att pepsin vid en koncentration av 1 mg / ml. Se till att pepsinet är helt upplöst (inga partiklar) före användning detta kan påskyndas genom att vortexa pepsinet lösningen.
- Lägg pepsinet / HCl-lösning till scintillation flaskan med ECM pulvret så att ECM är en koncentration på 10 mg / ml.
- Rör lösningen kontinuerligt under 60-65 timmar, regelbundet skrapa ner sidorna av flaskan med ett väga sked eller spatel.
- pH justering
- Detta steg görs för att få vätskan matris materialet fysiologiska pH och att inaktivera pepsin, hålla den från att fasthålla ECM ytterligare. Återigen, se till att använda filtrerad lösningar gjorda med Millipore vatten.
- 1 M NaOH läggs till vara 1 / 10 den ursprungliga volymen. Testa pH vid denna punkt och tillsätt små mängder (2-10 l) av NaOH eller HCl så att den önskade pH (7,4) är nådd. Håll reda på alla små mängder som tillsätts för att neutralisera eller tas bort för pH-test. När lösningen har neutraliserats, lägga 10x PBS för att vara 1 / 10 den slutliga volymen (1 / 9 den aktuella volymen). Bestäm koncentrationen av injicerbara ECM och sedan lägga 1x PBS för att nå önskade slutliga samarbetencentration, här 6 mg / ml.
- Karakterisering av injicerbara ECM kan göras via SDS-PAGE, Blyscan Colorimetric GAG-analys och masspektroskopi.
- Vid denna punkt kan matrisen materialet injiceras in vivo för att bilda en klätterställning för hjärtinfarkt tissue engineering.
- Biotin-märkning
- ECM kan märkas med biotin före injektion för enkel visualisering av den injicerade ECM.
- Förbered en 10 mM lösning av Biotin och lägga till den injicerbara ECM i förhållandet 0.3mg/mg. ECM bör vara önskad koncentration för injektion. Om injicera vid en koncentration på 6 mg / ml, tillsätt 40 mikroliter Biotin per 1 ml ECM. Före injektion, hålla biotin-ECM-lösningen på is i minst 1 timme.
- Alla processteg kan utföras vid rumstemperatur. För att hålla injicerbara matris från gelbildande, kan pH-justering steg göras på is.
3. Myocardial Injektioner
- Injektion förberedelse
- För honråttor (225-250 g) som används här, var 75 mikroliter injektioner av pH 7,4 injicerbara ECM upprättats i 0,1 ml sprutor tippas med 30 gauge nålar. Om hanråttor (375-400 g) användes, kunde 90 mikroliter injiceras.
- Alla kirurgiska varor bör steriliseras före operationen, här använder vi ett autoklaveras kirurgiska Pack som innehåller alla nödvändiga verktyg.
- På dagen för operationen, är ett Harlan Sprague-Dawley råttor sövda med isofluran på 5%, intuberade med ett otoskop, och sedan hållas på 2,5% isofluran under hela förfarandet.
- Lägg konstgjorda riva salva till djurets ögon för att skydda mot torrhet och hår. Administrera 3 mL laktat Ringers lösning för hydrering under operation. Detta bör göras via subkutan injektion i nedre delen av buken.
- Placera djuret i liggande position på kirurgiska bordet och försiktigt tejpen lemmar. Använd Clippers att ta bort hår på magen och vakuum utan hår innan skrubbning.
- Gör en serie små injektioner (cirka 50 mikroliter vardera) på 2% lidokain längs en diagonal från zyphoid processen till den nedre högra sidan av buken. Sen skrubba tre gånger med Betadine, med början i mitten och rör sig utåt. Upprepa med 70% etanol. Täck djuret med hjälp av ett kirurgiskt draperi med färdiga runda fönster, säkert med handduk klämmor, om det behövs.
- Med hjälp av en nr 10 skalpell göra ett 3-4 cm snitt från xyphoid processen till den nedre högra sidan av buken. Leta xyphoid process och dissekera lodrätt ned genom muskeln till höger, var noga med att undvika de stora fartyget till höger. När du har dissekerat genom muskeln, använd sax för att klippa sidled genom muskeln, utsätta membran. Var noga med att undvika levern.
- Med hjälp av en 36 tums längd 3-0 Vicrile sutur och ett par peanger, kör en nål genom zyphoid processen och dra sutur halvvägs igenom. Tejpa ändarna av sutur tillsammans och fixa det till en punkt ovanför och bakom djuret i huvudsak lyfter zyphoid upp och exponera membranet. Med en annan 36 tums längd 3-0 Vicrile suturer och köra en nål genom muskeln närmast xyphoid processen och, återigen, dra igenom och fäst ändarna till en annan punkt till höger om den kirurgiska tabellen, helt utsätta kirurgiska hålighet.
- Vid det här laget borde du kunna se hjärtat genom membranet. Använd en liten par microforceps råtta tand, ta mitt i mellangärdet, dra ut mot dig och gör ett mycket litet snitt med trubbig sax. Det är oerhört viktigt att använda mycket slö sax för att undvika att peta i lungorna. När detta hål har gjorts, kommer lungorna tryckas in, så att du kan göra ett 2-3 cm snitt vertikalt genom membranet för att visualisera hjärtat.
- Sätt i en 3-tums Q-tips till vänster om hål att driva lungorna ur vägen. Använda en handduk klämma för att säkra Q-tip på plats. Använd en annan tops för att flytta höger lunga ur vägen för att lokalisera hjärtsäcken. Använda ett par microforceps och ett par stora räfflad tång, riva genom hjärtsäcken, utsätta spetsen av hjärtat. Om djuret har tidigare genomgått en infarkt förfarande kommer hjärtsäcken redan vara frånvarande.
- Ta spetsen av hjärtat med microforceps råtta tanden och injicera vätskan matris materialet en tredjedel av vägen upp från spetsen. Sätt nålen parallellt med epicardial ytan och spruta med avfasade kanten av nålen till vänster. Var noga med att undvika den stora hjärtvenen. Vänta ett par sekunder innan du tar bort nålen. Du bör se en blekning av vävnaden vid injektionsstället.
- Städa upp blod i hålrum och ta bort handduken klämma och Q-tip som höll höger lunga. Använd böjda microhemostats och råttantand microforceps att stänga membranet. Göra en första knut och sedan använda sågtandade pincett och microhemostats att stänga membran med en kontinuerlig sutur och en avsmalnande nål. Innan du stänger helt, sätter PE160 sug slangar och använda en 10 ml spruta för att evakuera brösthålan som suturen dras åt.
- När väl evakueras och stängde bör membranet vara konkav. En konvex membran visar att det fortfarande finns luft i kaviteten.
- Vid denna punkt isofluran kan vridas ner till 1%.
- Ta ut både 3-0 Vicrile suturer hålla hålighet öppna. Använd sterilt vatten för att återfukta muskeln, torka överskottet bort med en tops eller steril gasbinda. Använd en ny längd på 3-0 sutur för att stänga muskellagret med intermittent suturer.
- Vid denna punkt kan isofluran stängas av.
- Rengör området med sterilt vatten och häftklamrar använda för att stänga huden. Om märlor stör undersökningen kan 5-0 Proline sutur också användas. I så fall använda en omvänd skärning (RC) nål för att stänga huden med intermittent suturer. I båda fallen plats kirurgiskt lim över den stängda snittet.
- Använd en tops för att smörja snittet platsen med en trippel-antibiotisk salva.
- Låt djuret att återhämta sig under 100% syrgas.
- När djuren börjar andas runt fläkten, ta bort luftstrupen röret.
- När djuren sternala, administrera en subkutan injektion på 0,05 mg / kg av buprenorfinhydroklorid och återlämna dem till deras hem buren på en steril handduk.
- Djuren bör få postoperativ observation och vård.
- Vid tidpunkten sevärdheter, djuren euthanized och hjärtan bort för analys. Kort axel tvärsnitt tas och kan färgas med hematoxylin och eosin (H & E) för grov vävnad analys. På kort tid punkter kommer det injicerade området visas som en rosa, fibrösa nätverk som har spridit interstitially. Vid senare tidpunkter, kommer man iaktta en tillströmning av celler och en eventuell försämring av den injicerade matrisen efter 2 till 3 veckor. Om ECM var märkt med biotin innan injektion, kan det vara mer direkt synliga genom färgning av biotin med HRP-konjugerade streptavidin. Immunhistokemisk färgning kan användas för att identifiera specifika celler eller strukturer i injektion regionen, här bilderna har varit tillsammans färgas med ett FITC-konjugerat isolectin som binder till endotelceller och fluorescerar i grönt och en anti-glatt muskulatur aktin antikropp med en Alexafluor sekundär antikropp som rapporterar SMC i rött.
4. Representativa resultat
Föregående karakterisering av matris material som bereds på detta sätt visat att behålla en mängd olika makromolekyler. Specifikt fanns flera fibrösa proteiner och glykoproteiner identifieras via masspektrometri (tabell 1). Om matrisen material behandlas enligt detta protokoll visar sig inte längre innehåller en mängd komplexa makromolekyler, kan det vara så att decellularization protokollet som används är för hård. När fullt frystorkad ser torkade perikardiell ECM som mycket hård, skrynkliga papper. Typer av vävnad kommer att likna packning jordnötter. Om frästa väl bör ECM falla genom silen och samlas i burken längst ner. Om det finns fukt kvar i provet, ECM kommer klumpar ihop sig och fastnar i fräsning kammaren. Efter rötningen ska ECM lösningen vara en mjölkig färg och helt fri från synliga partiklar. Det kommer också att vara något mer trögflytande än HCl ensam. Om ECM inte smälta väl, kommer det fortfarande vara stora partiklar i flaskan, alternativt kan ECM krascha ut ur lösningen. Efter justering av pH, det finns inga synliga förändringar i lösningen, och ECM är fortfarande en grumlig, homogen vätska. Om det börjar gel, kommer att viskositeten ökar och det blir svårt eller omöjligt att dra materialet upp i en spruta. Om detta händer, utför steg pH-justering på is, med redan kyld lösningar. När injektionerna har upprättats, hålla dem på is tills det ska användas. Om injektionen lyckas bleker området runt nålspetsen och en liten bolus syns. Om detta inte följs, kan injektionen ha gått in i kammaren i stället för i väggen. När suturering djuret upp efter injektionen, rekommenderas noggrann stängning av membranet det viktigaste steget. Om det görs på rätt sätt, kommer membranet vara tätt mot lungorna och kommer att visas konkava. Om det finns någon luft kvar i lungorna, kommer membranet vara konvex eller har ett område där det ballonger ut. Vid undersökningen av histologi av injektionen regionen på ett tidigt tidpunkt (30 minuter till 4 timmar efter injektion), bör man se en rosa, fibrösa område som saknar celler detta är den ihop matrisen materialet efter injektion (Figur 2) . Nätverket sprider ofta interstitially och kan vara närvarande under hela många sektioner. En Possible förklaring till att se endast en mycket liten del av matrisen gel är att en del av injektionen missade intramural målet och var antingen injiceras i LV kammare eller läckt ut ur den injektion platsen. Dessutom, beroende på gelation tid, kan den interstitiella sprids varierar.
Figur 1. Polyakrylamidgelelektrofores (SIDA) resultat. (A) Molekylvikt standard. (B) Råtta svansen kollagen typ I (2,5 mg / ml) jämfört med solubilized människa (C) och svin (D) perikardiell ECM (7 mg / ml). Notera förekomsten av kollagen samt flera andra proteiner och peptider i perikardiell matrisen prover.
Tabell 1. ECM komponenter som identifieras med masspektroskopi.
Figur 2 Myocardial injektioner:. In vivo gelation. H & E färgning av mänskliga (A) och svin (B) perikardiell matris injektioner som har geléartad in vivo efter 45 minuter. Pilar betecknar matrisen plats, målat ljusare rosa än hjärtmuskeln. Skala bar är 500 ìm.
Figur 3. Vascular cell infiltration. Fluorescerande fläckar för fartyg i den injicerade människa (AC) och svin (DF) matris geler på två veckor. Endotelceller är märkta gröna (A, D), medan glatta muskelceller är märkta röda (B, E). Sammanslagna bilder ska visas i C och F. Skala bar är 100 ìm. Den vita streckade linjerna indikerar området matris injektion, som bestäms av H & E: s analys av ett närliggande avsnitt.
Figur 4. Stamceller i matris injektion regionen. En Hoescht bets för kärnor (blå) och c-kit (grön) identifierar stamceller i den mänskliga (A) och svin (B) matris injektion regioner. Skala bar med 50 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt för produktion av biologiskt framställda, injicerbara ställningar för hjärtinfarkt tissue engineering. Även om dessa metoder ursprungligen utvecklade för tillverkning och in vivo test av en hjärtinfarkt matris gel och presenteras här med en perikardiell matris gel, kan detta protokoll anpassas för användning med någon vävnad, förutsatt att vävnaden kan lämpligen decellularized. Decellularization ska utföras och verifieras innan användningen av dessa metoder, förekomst av DNA i matrisen gelen kan orsaka en oönskad immunsvar. Det finns en mängd olika sätt att decellularize material, och flera bra recensioner har skrivits i ämnet 3, 4.
När man förbereder en matris gel är det viktigt att urvalet är helt frystorkat, som alla kvarvarande fukt kommer att förhindra fräsning. Dessutom, för att undvika inandning av ECM pulver, alltid bära ansiktsmask vid fräsning. Slutligen är det viktigt att notera att när matrisen gel är avsedd för en in vivo-studie bör beredningen utföras på ett så sterilt sätt som möjligt för att minska risken för smitta som kan leda till infektion. Om att ändra detta protokoll för en annan vävnadstyp kommer vissa parametrar måste optimeras. Till exempel kan en förändring av koncentrationen av ECM vissa vävnader kräver en högre koncentration för att bilda en gel och en del kan gelen vid lägre koncentrationer. Dessutom kan de nödvändiga koktiden och pepsin koncentration variera om styrkan i den använda pepsin signifikant olika.
Det lilla djuret kirurgi som beskrivs i detta protokoll kan utnyttjas för injektion av alla in situ gelbildande material i LV fria väggen. Att undersöka cellbaserade terapier tissue engineering i hjärtat, kan detta protokoll som används för att injicera en kombination av celler och dessa biologiskt härledda geler. Således är dessa metoder ger en flexibel ram för att upprätta och in vivo karakterisering av biologiskt framställda geler för hjärtinfarkt tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Användning av djur: Alla experiment i denna studie utfördes i enlighet med de riktlinjer som offentliggjorts av Institutional Animal Care och använda kommittén vid University of California, San Diego och American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av NIH direktörens Nya Innovator Award Program, en del av NIH färdplanen för medicinsk forskning genom bidrag nummer 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. vill tacka NSF för en Graduate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized |
| Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Equipment: | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Labconco Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Surgical supplies: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Lactated Ringers Solution | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaine, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Artificial tear ointment | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Triple antibiotic ointment | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscope | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Stop cock | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| 3-0 Vicrile suture | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| 5-0 Proline suture | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| PE160 suction tubing | BD Biosciences | 427430 | |
| Clippers | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Skin staples/stapler | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| General supplies: | |||
| Stir plates | |||
| 0.1 M HCl | |||
| 1 M NaOH | |||
| 10x PBS | |||
| 1x PBS | |||
| 70% Ethanol | |||
| 0.1 mL syringes | |||
| 10 mL syringe | |||
| Q-tips | |||
| Surgical glue | |||
| Surgical drape | |||
| Towel clamps | |||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
