Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Устные Администрации Ротенон использованием принудительного кормления и анализ изображений Альфа-синуклеина включений в кишечной нервной системы

doi: 10.3791/2123 Published: October 26, 2010

Summary

Болезнь Паркинсона была связана с воздействием пестицидов. Здесь мы показываем, метод для доставки пестицидов помощью желудочного зонда на нужной концентрации и метод для анализа их влияния в альфа-синуклеина накопления в кишечной нервной системы.

Abstract

При болезни (PD) Паркинсона пациентов, сопутствующей патологии следует характерная картина с участием, в частности, кишечной нервной системы (ENS) 1,2, обонятельной луковице (OB), спинной ядра двигатель блуждающего (DMV) 3, intermediolateral ядре спинного мозга и 4 черной субстанции, что обеспечивает основу для постановки нейропатологических заболевания 4,5. ENS и ОВ наиболее подверженных нервных структур и первыми пострадают. Интересно, что PD было связано с пестицидами 6-8. Здесь мы показываем, подробно двух методов, используемых в нашем предыдущем исследовании 9. Для того чтобы проанализировать последствия ротенон действовать локально на ENS, мы вводить ротенон помощью желудочного зонда до одной летний C57/BL6 мышей. Ротенон является широко используются пестициды, что сильно тормозит митохондриального комплекса I 10. Очень липофильными и плохо всасывается в желудочно-кишечном тракте 11. Наши результаты показали, что введение 5 мг / кг ротенон не ингибирует митохондриальный комплекс Я активности в мышцах или головном мозге. Таким образом, предполагая, что с помощью нашего метода администрации ротенон не пересекали портальный системы и действовал исключительно на ENS. Здесь мы показываем, метод для управления использованием пестицидов зонд и протокола анализа изображений используется для анализа воздействия пестицидов в альфа-синуклеина накопления в ENS. Первая часть показывает метод, который позволяет внутрижелудочного введения пестицидов (ротенон) на желаемую точные концентрации. Второй метод показывает, полуавтоматическая анализа изображений для анализа протоколов альфа-синуклеина накопления в ENS использованием программного обеспечения для анализа изображений.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1) внутрижелудочного введения Ротенон

  1. Взвесьте животных.
  2. Рассчитать общий объем ротенон / транспортное средство решения необходимо. В этом случае 0,01 мл на грамм веса животного.
  3. Зарядка 1 мл шприц с ранее расчетный объем ротенон решение (0,625 мг / мл ротенон, 4% карбоксиметилцеллюлозы и 1,25% хлороформ) или транспортное средство решения (4% карбоксиметилцеллюлозы и 1,25% хлороформа). В данном случае это соответствует 5 мг / кг ротенон дозы.
  4. Возьмите мышь и, держа хвост мыши с одной стороны, растягивать кожу шеи, потянув ее с первыми двумя пальцами другой руки.
  5. Как только голова фиксируется между двумя пальцами, постное ее от ладони и поверните ее вверх тормашками. Закрепите хвост использованием четвертого и пятого пальцев.
  6. Хранение головой в сторону спины, пресса небо открывать рот мыши. Аккуратно ввести зонд в рот. Важно использовать зонд иглой, а не регулярные иглы. Медленно, перемещать зонд в направлении желудка достаточно далеко. Это позволит избежать материала попадая в легкие.
  7. Администрирование решение ротенон или транспортное средство, слегка нажав эмболии. После завершения строительства, медленно извлекать зонд.
  8. Место животное обратно в другой клетке, пока все животные из одной клетки сделаны.

2) Порядок Иммуноокрашивание

  1. После лечения, мышей под наркозом кетамин использованием 100 мг / кг унд Xylazin 10 мг / кг и intracardially озарен 4% Параформальдегид в PBS.
  2. Кишках извлекаются путем рассечения, и помещен в 15% сахарозы в одночасье. На следующий день, ткани передается до 30% сахарозы и инкубировали еще в течение ночи при 4 ° C.
  3. Ткани затем помещаются в ткани-тек и хранится в -80 ° C морозильнике до использования.
  4. Использование криостата, 20 микрон кишечника сечения передаются SuperFrost слайдов.
  5. Блокировка и иммунной процедур с использованием анти-βIII-тубулина и анти-альфа-синуклеина антитела Затем выполняется, как описано выше 9.

3) Альфа-синуклеина Включение анализа изображений

Рекомендуется, чтобы внешний человек не знают о происхождении образов »выполняет анализ. Таким образом, данные должны быть кодифицированы. Анализ изображений проводили с использованием ФИДЖИ программного обеспечения.

  1. Открытое конфокальной файл образа. Затем разделить каналы, так что можно работать по каждому каналу отдельно.
  2. Закрыть эти каналы, которые не будут использовать и выберите Анализ> Установить масштаб и набор Размер пикселя к 1. Установить известно расстояние до 0,13 (это будет зависеть от объективных и используемого разрешения) и нажмите на глобальном. Размер изображения теперь будет показано в микронах.
  3. Выберите альфа-канал синуклеина и выберите ганглия, убедитесь, что выбор охватывает ганглия во всех ломтиками.
  4. Пресс Изображение> Дублировать дублировать изображение. С ганглия выбрана, только изображение размером ганглия будут продублированы.
  5. Пресс Edit> Clear Outside. Часть изображения за пределами выделенной области станет черным.
  6. Дублируйте изображение снова, чтобы определить на последующих этапах, насколько хорошо процедуру пошел. Изображения, которые имеют высокий сигнал-шум на фоне отношения не должны использоваться для анализа изображений.
  7. Выберите Image> Adjust> Threshold и выберите MaxEntropy. Затем переходите на ломтики в обрезанное изображение и исходная для того, чтобы процедура прошла хорошо. Энтропийный порог выбирает уровень интенсивности сигнала на основе гистограммы изображения и только те пиксели с интенсивностью выше этого порога будет отображаться в белых над черными изображения.
  8. Выберите процесс, а затем нажмите Гладкий. Этот шаг превращает pixeled краев изображения в гладкими краями.
  9. Выберите процесс, а затем нажмите Binary, и выберите Сделать Binary. Изображение будет отображаться как черный на белом изображении.
  10. Дублируйте изображение выполнить следующий шаг на дублируются изображения.
  11. Нажмите на анализ> Анализ частиц. Затем выберите Показать: Очерки и нажмите на итоги. Остальные параметры должны быть листьями по умолчанию. Эта функция распознает общее количество пикселей с отношением сигнал, и те, которые сгруппированы вместе. Общей площади пикселей с сигнала и число групп пикселей и среднего размера, как сообщается.
  12. Сравните и выберите крупнейших срез, который регулирует хорошо. Ломтик будут отмечены.
  13. Скопируйте данные таблицы с общей альфа-синуклеина поверхность, число включений и средний размер частиц. Вставьте данные в таблицу Excel или аннотированного в другом месте.
  14. Вернуться на Фиджи и найти ранее выбранный срез в β-тубулина канал, и выберите его.
  15. Выберите область ганглии и нажмите на анализ, затем выберите мер. В другой таблице появятся показывающиеобщей площадью ганглия.
  16. Извлечение данных из таблицы Excel листа около альфа-синуклеина измерение или скопируйте ее вниз, в другом месте.
  17. Использование Excel, разделить различные параметры, полученные в альфа-синуклеина измерение ганглия поверхности, чтобы получить общую альфа-синуклеина поверхности и включение число нормированных ганглия размера.

4) Результаты представитель

Когда зонд протокола администрации выполняется правильно неудобства для животных, являются минимальными. Лечение с помощью этой концентрации ротенон позволяет местным действием ротенон на ENS без ротенон в крови и не торможение мышцы или мозга митохондриального комплекса I даже после 1,5 месяцев лечения (см. рисунок 1). Если анализ изображений выполняется правильно тщательный анализ альфа-синуклеина картина должна быть возможной. Это дает надежные данные об общем количестве альфа-синуклеина (общая площадь), альфа-синуклеина узор в клетку (количество включений) и наличие альфа-синуклеина включений (включение размера) (рис. 2).

Рисунок 1
Рисунок 1. Двигатель дисфункции у ротенон мышей без обнаружения ротенон в крови или ЦНС. , Стандартная (50 нг / мл) и хроматограммы из мозга образцы 20, 10 и 5 мг / кг мышей. В и С, количественное ротенон в крови (В) и ЦНС (С). B, крови 1 , 2 и 3 часа после обработки. Мыши были разделены на три группы (п = 3) и обрабатывают 2,5, 5, 10 и 20 мг / кг ротенон (п = 3), 300 мкл крови было добыто 1, 2 и 3 часа после ротенон администрации и объединенных вместе для ВЭЖХ анализа. C, мышей лечили в течение одной недели один раз в день с 5 (п = 3), 10 (п = 3) и 20 (п = 1) мг / кг ротенон, головного мозга и ствола мозга было добыто 1 и 2 часа после последний администрации и подготовлены для ВЭЖХ анализа. D, митохондриальная Комплекс I активности в мышцах и мозге образцов 1,5 месяца мышей.

Рисунок 2
Рисунок 2. Локально управляемый ротенон вызывает альфа-синуклеина фосфорилирования, накопления и агрегации с глиоз в ганглиях ENS. (Масштаб баров 20 мкм)., В, С, анти βIII-тубулина, альфа-синуклеина и DAPI окрашивание в двенадцатиперстной кишке (Б) и подвздошной кишки ( , С) секций. Стрелка в В, 1,5 месяца лечения индуцированной увеличился альфа-синуклеина точечным рисунком внутри кишечных нервных ганглиях системы по сравнению с 3-х месяцев управления (). Стрелка на С, 3-х месяцев лечения индуцированной образование более крупных альфа-синуклеина включений (диаметром> 6 мкм). D, иммунофлуоресцентного метода с использованием анти-альфа-синуклеина, Thioflavine S и DAPI. Стрелка в D, только 3 месяца мышей показало, агрегация этих больших альфа-синуклеина накоплений. E, E ', E'', изображение шаги анализ количественного определения. E, пример изображения, используемого в количественном показывает ганглия ENS immunostained против альфа синуклеина показывающие различных включений. E ', например изображения, полученные после анализа протоколов изображения. E'', перекрытия между некоторыми из оригинальных включений (зеленый) и представление, полученное после выполнения протокола (желтые линии). Ф.Г., количественную оценку эксперимента показана на AC было сделано с помощью автоматических сегментации и энтропии методов, основанных на порог. Single-звездочкой, P <0,05, и дважды звездочкой, P <0,01. F, каждый столбец представляет общую альфа-синуклеина поверхности / ганглия поверхности. G, каждый столбец представляет общее количество альфа-синуклеина включений / ганглия поверхности. Все графики показывают среднее ± SEM

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Внутрижелудочного введения была ранее выполнявшего 12. Однако, по рукописи Inden, в ротенон вводили растворенный в 0,5% соли карбоксиметилцеллюлозы натрия (CMSS) в одиночку. Ротенон является высокая liphophylic вещества. Таким образом, ротенон не может быть распущен в 0,5% CMSS в одиночку и будет осадок, если сделали это. Использования хлороформа создает равномерно распределенные ротенон подвески избежать осадки. Более того, из-за более высокой концентрации пестицидов в CMSS, окончательный объем вводимого раствора также значительно сократилось. Таким образом, снижение осложнений в администрации.

Мы рекомендуем использовать прямые gavages. Пищевода мышь прямо, заканчивая непосредственно на одной стороне живота. Таким образом, прямые gavages более адекватны для этой задачи.

Анализ изображений конфокальных изображений было сделано с использованием ФИДЖИ программного обеспечения. Плагинов для этой программы можно скачать в Интернете. Иммунофлуоресцентного окрашивания для анализа изображения было выполнено, как описано выше 9. Изображения были получены с помощью LSM 510 Zeiss конфокальной микроскопии. Важно, что изображения полученные с помощью такой же сигнал / шум. Это может быть достигнуто путем регулировки усиления и смещения до приобретения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Пан-Франциско Montojo имеет патент на рассмотрении в течение этой животной модели (Номер заявки PCT / EP 2009/005688).

Acknowledgments

Барри Педро де ла Маса Фонд поддержал эту работу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Germany
Chloroform Carl Roth GmbH 3313.1 Germany
Carboxymethylcellulose Sigma-Aldrich C5678 Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm Unimed Switzerland
LSM 510 Carl Zeiss, Inc.
FIJI http://pacific.mpi-cbg.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
  2. Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
  3. Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
  4. Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
  5. Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
  6. Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
  7. Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
  8. Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
  9. Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
  10. Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
  11. Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
  12. Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).
Устные Администрации Ротенон использованием принудительного кормления и анализ изображений Альфа-синуклеина включений в кишечной нервной системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pan-Montojo, F. J., Funk, R. H. Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (44), e2123, doi:10.3791/2123 (2010).More

Pan-Montojo, F. J., Funk, R. H. Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (44), e2123, doi:10.3791/2123 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter