In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Summary

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt door

Abstract

Humane kanker en de reactie op therapie is beter vertegenwoordigd in orthotope diermodellen. Dit document beschrijft de ontwikkeling van een orthotope muismodel van eierstokkanker, de behandeling van kanker door middel van orale toediening van geneesmiddelen, en monitoring van tumorcel gedrag in reactie op de medicamenteuze behandeling in real time met behulp van in vivo imaging systeem. In dit orthotope model worden ovariumtumor cellen die luciferase plaatselijk aangebracht door het injecteren van ze rechtstreeks in de muis slijmbeurs waar elke eierstok is bijgevoegd. Na injectie van D-luciferine, een substraat van vuurvlieg luciferase, luciferase-expressie brengende cellen te genereren bioluminescentie signalen. Dit signaal wordt gedetecteerd door de in vivo imaging-systeem en zorgt voor een niet-invasieve wijze van controle tumorgroei, distributie en regressie bij individuele dieren. Toediening van het geneesmiddel via orale sondevoeding zorgt voor een maximale dosering volume van 10 ml / kg lichaamsgewicht om rechtstreeks worden geleverd aan de maag en lijkt op de levering van geneesmiddelen in de klinische behandelingen. Daarom is hier beschreven technieken, de ontwikkeling van een orthotope muismodel van eierstokkanker, orale toediening van geneesmiddelen, en in vivo beeldvorming, zijn nuttig voor een beter begrip van de menselijke eierstokkanker en de behandeling en zal gerichter inspelen deze ziekte.

Protocol

I. Bereiding van Ovarian tumorcellen

1. Grow eierstokkanker cellijnen te drukken luciferase in cultuur. Bronnen van luciferase kan worden Firefly, Renilla, of andere soorten. Cellen die fluorescerende eiwitten kunnen ook worden gebruikt. Voor deze demonstratie gebruiken we een eierstokkanker cellijn, OVCAR5 uitdrukken vuurvlieg luciferase.
2. Oogst cellen met behulp van routine celcultuur techniek.
3. Houd de celsuspensie (10.000 cellen / microliter) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs totdat de tijd van de injectie.

II. Intrabursale Injectie

Deze procedure vereist hulp van een tweede persoon. Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Dit geldt ook voor het dragen van chirurgische kleding en het gebruik van steriele chirurgische instrumenten, de spuit en naalden.

1. Bereid de verdoving oplossing door het mengen van 3 ml ketamine hydrochloride (100 mg / ml), 1,6 ml van xylazine hydrochloride (100 mg / ml), 1,5 ml acepromazine (10 mg / ml), en 20 ml 0,9% natriumchloride.
2. Controleer het identificatienummer van het dier en de waarneembare gezondheid. Verdoven van het dier met voorbereide ketamine-xylazine-acepromazine anesthesie via intraperitoneale (ip) injectie met een dosis volume van 8 ~ 9 ml / kg lichaamsgewicht (BW).
3. Bevestigen dat het dier onder een aanvaardbaar vlakte van anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen met een tang of vingers om achterpoten van het dier poten. Als er pedaal reflex, wachten op een diepere vlakte van anesthesie totdat het dier niet reageert op deze procedure.
4. Leg het dier dorsale kant naar boven op een steriel gaasje met zijn hoofd afgekeerd en zijn staart naar u toe. Het punt van de incisie is gelegen aan de linker-of rechterkant van de middenlijn en boven de eierstokken. Scheren of de vacht nat met 70% alcohol op de incisie punt.
5. Til de natte huid met behulp van pincet en een kleine incisie met de schaar op de dorsomediale positie en direct boven de eierstokken vet pad. De ovariële vetkussentje moet zichtbaar zijn onder het oppervlak van de peritoneale muur. Vet pad is gemakkelijk te herkennen aan zijn witte kleur in contrast met de donkere roze weefsel eromheen.
6. Til de peritoneale wandbekleding en maak een kleine snede zoals hierboven beschreven (5).
7. Plaats een steriele zoutoplossing gedrenkt gaasje op de middellijn grenzend aan de incisie. Zoek de ovariële vet pad en trek het voorzichtig uit en de rest het op het gaas. Het stabiliseren van de eierstok door het vastklemmen van de dikke pad met een bulldog clip. Onder een microscoop ontleden, de positie van de eierstok mogelijk te maken voor het inbrengen van de naald (30 gauge, G) in de eileider tubulus bocht die leidt tot de slijmbeurs. Als de naald wordt ingebracht in de juiste positie, moet het zichtbaar zijn onder de slijmbeurs.
8. Duw de zuiger van de spuit om 5 ul van celsuspensie injecteren tussen de slijmbeurs en de eierstokken, terwijl de spuit is gepositioneerd om de plaats van injectie. Deze stap vereist twee personen. Een persoon duwt de zuiger, terwijl de andere persoon houdt positionering van de naald. Snel te verwijderen van de naald op de prikplaats seal maar voorzichtig genoeg om de bursa en de tubulus scheuren. De slijmbeurs zou moeten verschijnen enigszins opgezwollen met de juiste injectie.
9. Laat het vet pad van de bulldog clip en voorzichtig vervang de voortplantingsorganen en dikke kussen terug in de buikholte. Sluit het lichaam muur door te trekken de bovenste peritoneale bekleding over de lagere voering. Sluit de huid met chirurgische nietjes of wond clips.
10. Plaats de herstellende dier terug in zijn kooi en zorgen voor een veilige warmtebron om onderkoeling te voorkomen en te versnellen herstel. Bewaken van de ademhaling en het gemak, de terugkeer van de spiertonus en de mogelijkheid om vrijwillig te verplaatsen. Dit zijn allemaal goede indicatoren van de progressie naar herstel. Nietjes of clips wond kunnen verwijderd worden zeven of meer dagen na de operatie.

III. Orale sondevoeding Administratie

1. Gebruik een 18 ~ 20 G maagsonde naald of het voeden buis met een afgeronde punt. De maagsonde naald mag niet langer zijn dan de afstand tussen het uiteinde van het hoofd van het dier tot de laatste rib.
2. Controleer de dieren identificatienummer en waarneembare gezondheid. Voorzichtig nekvel het dier vast te pakken door de huid over de schouders met duim en vingers. De terughoudendheid moet net stevig genoeg voor de voorpoten worden uitgebreid tot elke kant en uit de weg. Het dier moet niet in staat zijn te begrijpen in de naald.
3. Trek rug van het dier hoofd met je wijsvinger, de vorming van een rechte lijn door de hals en de slokdarm. Ondersteuning van het dier terug met de binnenkant van je duim.
4. Voorzichtig en zonder geweld, steek de maagsonde naald aan beide zijden van de mond en op de tong. In een vloeiende beweging, moet de naald gaan tegen het dak van de mond en de slokdarm. Gravity moeten leiden van de naald naar beneden zonder aan weerstand. Als er een resistance, verwijder dan de naald en opnieuw beginnen. Van het dier gag en slikken reflex kan worden geactiveerd tijdens het inbrengen. Er moet echter worden geen weerstand of hijgen van het dier. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het dier ademt wanneer de naald op zijn plaats is door het controleren van de beweging van de neusgaten en de borst.
5. Langzaam duw zuiger van de spuit om de dosis volume afzien.
6. Verwijder voorzichtig de maagsonde naald onder een zelfde hoek en weg verloopt als de manier waarop het is ingevoegd de slokdarm.
7. Ga terug het dier aan zijn kooi en te controleren ademhaling en gedrag voor 5 ~ 10 minuten.

IV. In vivo beeldvorming

We gebruiken de Caliper Life Sciences om het gedrag van cellen geïnjecteerd in intrabursale holte te controleren. Experimenten met dit systeem hebben meestal een looptijd van 4 ~ 16 weken vanaf het moment van de tumor implantatie.

1. Bereid de oplossing van D-luciferine (substraat van vuurvlieg luciferase) door het oplossen van 5 ~ 20 mg in 1 ml PBS en wordt gefilterd door 0.22 urn membraan voor sterilisatie.
2. Laad de inductie kamer door te draaien op zowel de zuurstof en de isofluraan gas. Zet de gastoevoer naar de inductie kamer alleen. De isofluraan debiet wordt gehandhaafd op een laag niveau tot de dieren zijn klaar om te worden afgebeeld.
3. Controleer de dieren identificatienummer en waarneembare gezondheid. Plaats het dier in de inductie kamer belast met isofluraan gas.
4. Haal de dieren uit de kamer als het dier lijkt te zijn verdoofd. Lever 200 pi van de bereide luciferine oplossing via ip injectie met 30 G naald. Het is belangrijk om het tijdstip van injectie record in te houden de tijd consistent tussen luciferine injectie en imaging prestaties gedurende het onderzoek.
5. Plaats de luciferine-geïnjecteerde dier terug in de inductie kamer.
6. Stel het imaging systeem om de juiste instellingen. Zorg ervoor dat het systeem te initialiseren voordat u tot aanschaf van de eerste dier beeld.
7. Zet de gastoevoer naar de inductie kamer en zetten de gasstroom naar de beeldvorming kamer.
8. Plaats het verdoofde dier dorsale of ventrale zijde naar boven. Zorg ervoor dat de dieren 'neus plaats in een neus om de juiste anesthesie inductie te houden. Zorg ervoor dat het dier binnen het "point of interest grid", zoals aangegeven door groene verlichting.
9. Sluit de deur van de kamer en het verwerven van het beeld op het juiste moment. Tijd kan worden bepaald door kinetiek.
10. Verwijder het dier uit de beeldvorming kamer en plaats deze terug in zijn kooi. Monitor van de dieren 'herstel, zoals beschreven in "intrabursale Injection".

V. representatieve resultaten

Figuur 1. In vivo beeldvorming van de ovariële tumor cellen in een orthotope muismodel. OVCAR5 cellen die luciferase werden intrabursally geïnjecteerd in rechter eierstok en afgebeeld in de tijd. Foto's zijn genomen 13 (links), 17 (midden), en 22 (rechts) dagen na de injectie met behulp van de IVIS Spectrum imaging systeem. Dorsale zijde wordt getoond in het bovenste paneel en buikzijde is in onderste paneel. Merk op dat de peritoneale verspreiding van tumorcellen 22 dagen na de injectie.

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving voortgebracht door Institutional Animal Care Fox Chase Cancer Center en het gebruik Comite.

Discussion

Eierstokkanker is de belangrijkste oorzaak van de dood van alle gynaecologische maligniteiten ^1. Het hoge sterftecijfer van deze ziekte is grotendeels te danken aan de late diagnose en het ontbreken van betrouwbare diagnostische methoden ^2. Bovendien, conventionele chemotherapie ontmoetingen vaak chemoresistance en terugval van kanker ^3. Daarom is nieuwe therapieën nodig is om effectief te richten op deze ziekte. In de ontwikkeling van nieuwe therapie gericht op de menselijke behandeling van eierstokkanker, is het essentieel om een ​​representatief diermodel te ontwikkelen.

Een orthotope diermodel heeft voordelen ten opzichte van conventionele xenotransplantaatmodellen (bijv. subcutane of intraperitoneale injecties van tumorcellen) in dat 1) het reproduceert de primaire plaats van tumorvorming, 2) het vertegenwoordigt gemeenschappelijke plaats van uitzaaiingen, en 3) biedt tumorcellen aan interactie met de juiste ^{micro-4, 5, 6, 7, 8.} Knaagdieren hebben een unieke bursitis membraan dat de eierstok omringt en is continu met de eileider. Deze unieke anatomie van knaagdieren kan injectie van ovarium tumorcellen orthotopically. Intrabursally ingespoten ovarium tumorcellen zich gedragen vergelijkbaar met menselijke ziekten, waardoor steeds binnen de intrabursale membraan en de verspreiding in de buikholte als tumor vordert. Injectie van cellen die stabiel tot expressie luciferases of fluorescerende eiwitten maakt het ook mogelijk volgen het gedrag van tumorcellen in real time. Bioluminescente en / of TL-imaging-technologie maakt het mogelijk om meerdere malen image tumorcellen over een langere periode van tijd en studie groei van de tumor, de distributie en regressie bij het ​​niet-invasieve manier ^{9, 10, 11.}

Bij het vaststellen van de orthotope model, is het essentieel om de naald snel te verwijderen van de slijmbeurs na de injectie. Abrupte verwijdering van de naald sluit de punctieplaats en voorkomt het lekken van de geïnjecteerde cellen. Echter, op hetzelfde moment, zou het verkeer worden zacht niet aan de slijmbeurs scheuren. Als lekkage optreedt tijdens de injectie, kan het cellen zaad in de buik en mogelijk verwarren de studie, dat wil zeggen, premature verspreiden buiten de eierstok. In dat geval dient de specifieke dier worden vastgelegd en gevolgd voor de ontwikkeling van meerdere tumor in het buikvlies voorafgaand aan de behandeling of als alternatief geëlimineerd uit de daarop volgende analyses. Voorafgaand aan het uitvoeren van orale sondevoeding, is het essentieel om de lengte van de buis maagsonde controleren door te meten vanaf het uiteinde van het hoofd van de dieren aan de laatste rib. Het is nuttig om de buis teken bij de neus van het dier en doe de buis niet door het verleden dit merk. Het inbrengen van de buis voorbij dit merkteken kan resulteren in een perforatie van de maag. Het bepalen van de lengte van de buis is vooral belangrijk bij jonge dieren of dieren met een gewicht van minder dan 20 g. Na het inbrengen van de maagsonde naald de slokdarm, mag er geen weerstand of strijd van het dier. Het is belangrijk om niet de oplossing of suspensie toedienen te snel, omdat dit kan leiden tot reflux en vervolgens te leveren onjuiste dosis volume, evenals het toevoegen van stress bij de dieren. Voor vergelijkbare beeldvorming resultaten van tijd tot tijd, is het wenselijk om de tijd consistent tussen de injectie van luciferase substraat en beeldvorming. Het tijdsverloop kan worden bepaald door het nemen van reeks beelden na substraat injectie en let op de kinetiek van signalen. Ontwikkeling van een orthotope muismodel van eierstokkanker, orale toediening van geneesmiddelen, en in vivo beeldvormende technieken zijn nodig voor een beter begrip van de ontwikkeling en de verspreiding van kanker van de eierstokken en de evaluatie van nieuwe therapeutische regimes die uiteindelijk kunnen verbeteren van de uitkomst van patiënten met deze dodelijke ziekte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796