В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Summary

Ортотопическая животных моделях рака яичников повторить лучше заболеваний человека и, следовательно, улучшения нашего понимания прогрессию рака и ответ опухоли на лечение. Мышиной модели получает intrabursal инъекции люциферазы-экспрессирующие клетки яичников опухоли. Лечение осуществляется через оральный зонд. Рост опухоли контролируется

Abstract

Человеческого рака и ответ на терапию лучше представлены в ортотопической животных моделях. Эта статья описывает развитие ортотопической мышиной модели рака яичников, лечение рака посредством устных доставки лекарственных препаратов, а также мониторинг опухоли поведение клеток в ответ на препарат лечение в режиме реального времени с помощью системы визуализации в естественных условиях. В этой ортотопической модели, яичников опухоль клеток, экспрессирующих люциферазы применяются местно, вводя их прямо в мышь Бурса, где каждый яичник прилагается. После введения D-люциферин, субстрат люциферазы светляков, люциферазы-клеток, экспрессирующих генерировать сигналы биолюминесценции. Этот сигнал регистрируется в системе естественных изображений и позволяет неинвазивным средством контроля опухолевого роста, распределения и регресс в отдельных животных. Препарата через оральный зонд обеспечивает максимальную громкость приеме 10 мл / кг массы тела, чтобы быть доставлен непосредственно в желудке и очень напоминает доставки лекарственных препаратов в клинической терапии. Таким образом, методы, описанные здесь, развитие ортотопической мышиной модели рака яичников, перорального применения лекарственных средств, и в естественных изображений, являются полезными для лучшего понимания человеческого рака яичников и лечения и улучшит, направленных на эту болезнь.

Protocol

I. Подготовка Клетки опухоли яичников

1. Рост рака яичников клеточных линий выражения люциферазы в культуре. Источники люциферазы можно Firefly, Renilla, или других видов. Клетки, экспрессирующие флуоресцентных белков также может быть использован. Для этой демонстрации мы используем клетка рака яичников линии, OVCAR5, выражая люциферазы светляков.
2. Урожай клеток, используя обычный метод клеточных культур.
3. Держите клеточной суспензии (10000 клеток / мкл) в фосфатном буферном растворе (PBS), на льду, пока время инъекции.

II. Intrabursal инъекций

Эта процедура требует помощи со второго человека. Все хирургические вмешательства проводятся в асептических условиях. Это включает в себя ношение хирургической одежды и использованием стерильных хирургических инструментов, шприцев и игл.

1. Подготовка анестезии раствор путем смешивания 3 мл кетамина гидрохлорид (100 мг / мл), 1,6 мл ксилазина гидрохлорид (100 мг / мл), 1,5 мл acepromazine (10 мг / мл) и 20 мл 0,9% натрия хлорида.
2. Проверка идентификации животных и номер наблюдаемого здоровья. Анестезию животного с подготовленными кетамин-ксилазина-acepromazine анестезии с помощью внутрибрюшинного (ф) инъекции дозу объемом 8 ~ 9 мл / кг массы тела (BW).
3. Убедитесь, что животное находится под приемлемый равнине анестезии, выполняя носок щепотку пинцетом или пальцами задних лап животного. Если есть педали рефлекс, ждать глубокой равнине анестезии, пока животное не реагирует на эту процедуру.
4. Положите сторону животного спинные на стерильные марлевые площадку с его головы смотрели в противоположную сторону и ее хвост, обращенной к вам. Точки разреза расположена слева или справа от средней линии и выше яичников. Бритье или влажной шерсти с 70% спиртом в разрез точки.
5. Поднимите смоченный кожу с помощью пинцета и сделать небольшой разрез с ножницами в дорсомедиального позицию и прямо над жировой ткани яичников. Площадку яичников жира должно быть видно под поверхностью брюшной стенки. Жировая ткань является легко узнаваемый по его белым цветом, в отличие от темно-розовой ткани, окружающие его.
6. Аккуратно поднимите перитонеального облицовки стен и сделать небольшой надрез, как описано выше (5).
7. Место стерильным солевым пропитанной марли площадку на прилегающей к средней линии разреза. Найдите яичников жировая ткань и осторожно потяните его и остальных его на марлю. Стабилизировать яичников, зажимая жировой ткани с клипа бульдога. Под микроскопом рассекает, положение яичников целью создания условий для введения иглы (30 калибр, G) в яйцевод изгиб канальцев, ведущих к Бурсе. Когда игла вводится в правильном положении, она должна быть видна в Бурсе.
8. Аккуратно нажмите поршень шприца для введения 5 мкл клеточной суспензии между бурсы и яичников в то время как шприц позиционируется месте инъекции. Этот шаг требует двух человек. Один человек толкает поршень, а другой человек сохраняет позиционирование иглы. Удалите иглу быстро, чтобы запечатать пункции, но осторожно, чтобы не рвать бурсы и канальцев. Сумка должна казаться слегка растянут надлежащего инъекции.
9. Выпуск жировой ткани из клипа бульдога и аккуратно заменить репродуктивного тракта и жира обратно площадку в брюшную полость. Аккуратно закройте стенки тела, потянув верхней перитонеальной подкладки на нижнюю подкладку. Закрыть кожу хирургических скоб или рана клипов.
10. Место восстановления животное обратно в свою клетку и обеспечить безопасный источник тепла, чтобы избежать переохлаждения и ускорить выздоровление. Монитор скорости дыхания и легкость, возвращение тонуса мышц, а также возможность добровольно двигаться. Все это хорошие показатели движения к выздоровлению. Скобы или ранить клипы могут быть удалены 7 или более дней после операции.

III. Устные зонд администрации

1. Используйте 18 ~ 20 G зонд иглу или зонд для искусственного кормления с закругленным кончиком. Желудочный зонд игла должна быть не больше, чем расстояние от кончика головы животного на его последнего ребра.
2. Проверьте животных идентификационный номер и наблюдаемых здоровья. Аккуратно загривок животного, держа кожу на плечах при помощи большого пальца и пальцев. Принуждения должны быть только фирмы достаточно для передних конечностей, будет продлен в каждую сторону и в сторону. Животное не должно быть в состоянии понять на иглу.
3. Осторожно потяните спину головы животного с указательным пальцем, образуя прямую линию через шею и пищевода. Поддержка спины животного с внутренней части вашего пальца.
4. Аккуратно и без усилий, вставьте зонд иглы в обе стороны от устья и более языка. В одном движении, игла должна пройти против неба и вниз по пищеводу. Гравитация должны направлять иглу вниз, не встречая сопротивления. Если есть resistanсе, удалить иглу и начать все заново. Кляп животного и глотать рефлекс может быть вызван во время вставки. Тем не менее, не должно быть никакого сопротивления или задыхаясь от животного. Важно, чтобы убедиться, что животное дышит, когда игла находится в месте, проверяя движение ноздрей и грудь.
5. Медленно нажмите поршень шприца обойтись объема дозы.
6. Аккуратно снимите зонд иглу под тем же углом, и путь, как путь он вставлен вниз по пищеводу.
7. Вернуться животных в клетку и дыхание контролировать и поведение в течение 5 ~ 10 минут.

IV. В Vivo изображений

Мы используем суппорт наук о жизни, чтобы контролировать поведение клеток вводили в intrabursal полости. Эксперименты с использованием этой системы обычно имеют сроки от 4 ~ 16 недель с момента имплантации опухоли.

1. Подготовка решения D-люциферин (субстрат люциферазы светляков) путем растворения 5 ~ 20 мг в 1 мл PBS и фильтрацией через 0,22 мкм мембраны для стерилизации.
2. Зарядка индукции камеры, включив как кислород и изофлуран газа. Включите подачу газа индукции камеры только. Изофлуран расход поддерживается на низком уровне, пока животные готовы для включения в образ.
3. Проверьте животных идентификационный номер и наблюдаемых здоровья. Место животное в индукции камеры предъявлено обвинение в изофлуран газа.
4. Удаление животного из камеры, когда животное оказывается под наркозом. Доставить 200 мкл приготовленного раствора люциферин через IP инъекций применяют 30 G иглу. Важно, чтобы записать время инъекции, чтобы сохранить время последовательно между люциферин впрыска и визуализации производительности на протяжении всего исследования.
5. Место люциферин впрыском животное обратно в камеру индукции.
6. Установить системе формирования изображений соответствующие настройки. Убедитесь, что для инициализации системы до приобретения первого изображения животных.
7. Выключите поток газа к индукции камеру и включите потока газа в камеру изображения.
8. Место под наркозом спинной животного или вентральной стороной вверх. Убедитесь, что место носа животного в носовой обтекатель для поддержания надлежащего индукции анестезии. Убедитесь, что животное находится в пределах "достопримечательность сетке", как указано зеленой подсветкой.
9. Закрыть дверь камеры и получить изображение в соответствующее время. Время можно определить по кинетике.
10. Удалить животное от изображения камеры и поместить его обратно в свою клетку. Монитор восстановлению животных, как описано в "Intrabursal инъекций".

Результаты В. представитель

Рисунок 1. В Vivo изображений клеток яичников опухоли в ортотопической модели мыши. OVCAR5 клеток, экспрессирующих люциферазы вводили intrabursally в правом яичнике и отображаемого с течением времени. Изображения были приняты 13 (слева), 17 (в центре) и 22 (право) дней после инъекции использованием изображений ИВИС спектра системы. Спинная сторона показана на верхней панели и брюшной стороне в нижней панели. Обратите внимание, что перитонеальный распространение опухолевых клеток 22 дней после инъекции.

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Институциональные животных Fox Chase Cancer Center Уход и использование комитета.

Discussion

Рак яичников является ведущей причиной смерти среди всех злокачественных гинекологических ^1. Высокий уровень смертности от этой болезни в значительной степени из-за его поздней диагностикой и отсутствием надежных методов диагностики ^2. Кроме того, традиционной химиотерапии часто встречается устойчивость к химическому воздействию и рецидива рака ^3. Таким образом, роман терапии необходимо эффективно целевой этого заболевания. В развитие новой терапии ориентации человеческого рака яичников, важно разработать модель представитель животного.

Ортотопической модели животных имеет преимущества по сравнению с обычными моделями ксенотрансплантата (например, подкожного или внутрибрюшинного введения опухолевых клеток) тем, что 1) он воспроизводит основной сайт образования опухоли, 2) она представляет общий сайт метастазов, и 3) он обеспечивает опухолевых клеток к взаимодействовать с соответствующими микроокружения ^{4, 5, 6, 7, 8.} Грызуны имеют уникальную бурсальной мембраны, которая окружает яичника и непрерывно яйцевода. Эта уникальная анатомия грызунов позволяет инъекцию клеток опухоли яичников orthotopically. Intrabursally вводили клетки опухоли яичников ведут себя подобно человеческой болезни, тем самым, растущее внутри intrabursal мембрану и распространяется в брюшную полость, как опухоль прогрессирует. Инъекции клеток стабильно выражения люцифераз или флуоресцентные белки также позволяет отслеживать поведение опухолевых клеток в реальном времени. Биолюминесцентный и / или флуоресцентных технологий визуализации позволяет многократно изображение опухолевых клеток в течение длительного периода времени и изучения опухолевого роста, распределения и регрессии в неинвазивный способ ^{9, 10, 11.}

При установлении ортотопической модели, крайне важно, чтобы быстро удалить иглу из сумки при инъекции. Резкие удаления иглы печатей пункции и предотвращает утечку вводили клетки. Тем не менее, в то же время, движение должно быть мягким, чтобы не разорвать Бурса. Если утечка происходит во время инъекции, это может привести к клеткам семя в живот и, возможно, путают исследования, т.е., преждевременное распространение за пределы яичника. В этом случае конкретные животные должны быть зарегистрированы и последовал за развитие нескольких сайтов опухоль в брюшной полости до начала лечения или же исключены из последующего анализа. Перед проведением устной желудочный зонд, очень важно проверить длину зонда трубка, измеряя от кончика головы животного до последнего ребра. Это полезно, чтобы отметить трубку в нос животного и не проходите мимо трубки этой отметки. Введение трубки прошлом этот знак может привести к перфорации в желудок. Определение длины трубы особенно важно для молодых животных или животных весом 20 грамм При вставке зонд иглу вниз по пищеводу, не должно быть никакого сопротивления или борьбы с животным. Очень важно не вводить раствор или суспензию слишком быстро, так как это может привести к рефлюкса, а затем доставить неточной объем дозы, а также добавление стресс для животного. Для сопоставимости результатов визуализации, время от времени, желательно, чтобы сохранить время последовательно между инъекцией люциферазы подложки и изображений. Промежуток времени может быть определена путем принятия серии изображений после инъекции подложки и наблюдать кинетики сигналов. Развитие ортотопической мышиной модели рака яичников, перорального применения лекарственных средств, и в естественных изображений необходимые методы для лучшего понимания развития и распространения рака яичников и оценки новых терапевтических схем, которые могут в конечном итоге улучшить результат пациента с этой смертельной болезнью.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796