L'imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Summary

Modèles animaux orthotopique de cancer ovarien de reproduire la maladie humaine de mieux et donc améliorer notre compréhension de la progression du cancer et de la réponse tumorale au traitement. Un modèle de souris reçoit une injection intrabursal de la luciférase cellules tumorales exprimant l'ovaire. Le traitement est administré par gavage. La croissance tumorale est contrôlée par

Abstract

Cancer de l'homme et la réponse au traitement est mieux représentée dans les modèles animaux orthotopique. Ce document décrit le développement d'un modèle de souris orthotopique de cancer de l'ovaire, le traitement du cancer par administration orale de médicaments, et le suivi du comportement des cellules tumorales en réponse à un traitement médicamenteux en temps réel en utilisant dans le système d'imagerie in vivo. Dans ce modèle orthotopique, les cellules tumorales exprimant la luciférase de l'ovaire sont appliquées localement en leur injectant directement dans la bourse de souris où chaque ovaire est clos. Lors de l'injection de D-luciférine, un substrat de la luciférase de luciole, la luciférase cellules exprimant générer des signaux de bioluminescence. Ce signal est détecté par le système d'imagerie in vivo et permet un moyen non invasif de surveillance de la croissance tumorale, la distribution, et la régression chez des animaux individuels. L'administration du médicament par gavage permet un volume de dosage maximum de 10 mL / kg de poids corporel pour être livrés directement à l'estomac et ressemble étroitement à la distribution des médicaments dans les traitements cliniques. Par conséquent, les techniques décrites ici, le développement d'un modèle de souris orthotopique de cancer de l'ovaire, l'administration orale de médicaments, et l'imagerie in vivo, sont utiles pour une meilleure compréhension du cancer ovarien humain et le traitement et améliorer le ciblage de cette maladie.

Protocol

I. Préparation des cellules de tumeur ovarienne

1. Cultivez des lignes cellulaires de cancer ovarien exprimant la luciférase dans la culture. Sources de la luciférase peut être Firefly, Renilla, ou d'autres espèces. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent également être utilisés. Pour cette démonstration, nous utilisons une lignée de cellules du cancer ovarien, OVCAR5, exprimant la luciférase de luciole.
2. Récolte des cellules en utilisant la routine technique de culture cellulaire.
3. Gardez la suspension cellulaire (10.000 cellules / uL) en tampon phosphate salin (PBS) sur la glace jusqu'au moment de l'injection.

II. Injection Intrabursal

Cette procédure nécessite l'assistance d'un deuxième personne. Toutes les interventions chirurgicales sont effectuées dans des conditions aseptiques. Cela comprend en tenue chirurgicale et l'utilisation des instruments chirurgicaux stériles, seringues et des aiguilles.

1. Préparer la solution anesthésique en mélangeant 3 mL de chlorhydrate de kétamine (100 mg / ml), 1,6 ml de chlorhydrate de xylazine (100 mg / ml), 1,5 ml d'acépromazine (10 mg / ml), et 20 ml de chlorure de sodium à 0,9%.
2. Vérifiez le numéro d'identification de l'animal et la santé observables. Anesthésier les animaux avec des prêts kétamine-xylazine-acépromazine l'anesthésie par voie intrapéritonéale (IP) d'injection avec un volume de dose de 8 ~ 9 poids corporel mL / kg (mc).
3. Confirmez que l'animal est sous une plaine acceptable de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil avec une pince ou les doigts aux pattes arrières de l'animal. S'il ya pédale de réflexe, attendre une profonde plaine de l'anesthésie jusqu'à l'animal ne répond pas à cette procédure.
4. Posez la face dorsale des animaux sur une compresse stérile avec sa tête tournée vers sa queue et en face de vous. Le point d'incision est située à gauche ou à droite de la ligne médiane et au-dessus des ovaires. Se raser ou de la fourrure mouillée avec de l'alcool à 70% au point d'incision.
5. Soulever la peau humide en utilisant une pince et de faire une petite incision avec les ciseaux à la position dorsomédial et directement au-dessus du pavé de l'ovaire graisse. Le coussinet adipeux de l'ovaire doit être visible sous la surface de la paroi péritonéale. Coussinet adipeux est facilement reconnaissable par sa couleur blanche contraste avec le tissu rose foncé qui l'entourent.
6. Soulevez doucement le revêtement mural péritonéale et faire une petite incision comme décrit ci-dessus (5).
7. Placez un tampon imbibé de gaze stériles salins sur la ligne médiane adjacente à l'incision. Repérez le tampon de l'ovaire de graisse et retirez-le doucement et il reste sur la gaze. Stabiliser l'ovaire par serrage du coussinet adipeux avec une pince-notes. Sous un microscope, la position de la dissection de l'ovaire que pour permettre l'insertion de l'aiguille (calibre 30, G) dans le virage tubule oviducte menant à la bourse. Lorsque l'aiguille est insérée dans la bonne position, il devrait être visible sous la bourse.
8. Poussez doucement le piston de la seringue pour injecter 5 pi de suspension cellulaire entre la bourse et de l'ovaire tandis que la seringue est positionnée au site d'injection. Cette étape nécessite deux personnes. Une personne pousse le piston pendant que l'autre maintient le positionnement de l'aiguille. Retirer l'aiguille rapidement pour sceller le site de ponction, mais doucement assez de ne pas déchirer la bourse et des tubules. La bourse ne doit apparaître comme légèrement distendu par injection.
9. Relâchez le coussinet adipeux de la pince-notes et doucement remplacer l'appareil reproducteur et le dos du coussinet adipeux dans la cavité péritonéale. Fermez doucement la paroi du corps en tirant sur la paroi supérieure du péritoine sur le bas doublure. Fermer la peau avec des agrafes chirurgicales ou des clips plaie.
10. Placez l'animal récupération de retour dans sa cage et fournir une source de chaleur sûre pour éviter l'hypothermie et d'accélérer la récupération. Surveiller le taux de respiration et de la facilité, le retour du tonus musculaire et la capacité à bouger volontairement. Ce sont tous de bons indicateurs de la progression vers la guérison. Agrafes ou blessure peut être retiré 7 ou plus après la chirurgie jours.

III. Oral gavage

1. Utilisez un 18 ~ 20 G aiguille gavage ou alimentation par sonde avec un bout arrondi. L'aiguille de gavage ne devrait pas être plus long que la distance entre l'extrémité de la tête de l'animal à son dernière côte.
2. Vérifiez le numéro d'identification de l'animal et la santé observables. Doucement Scruff l'animal en le saisissant par la peau sur les épaules avec le pouce et les doigts. La contention doit être juste assez ferme pour les membres antérieurs d'être prolongée de chaque côté et à l'écart. L'animal ne doit pas être en mesure de saisir à l'aiguille.
3. Tirez doucement la tête de l'animal avec votre index, formant une ligne droite à travers le cou et l'oesophage. Soutien dos de l'animal à l'intérieur de votre pouce.
4. Doucement et sans force, insérer l'aiguille de gavage de chaque côté de la bouche et sur la langue. Dans un mouvement sans heurt, l'aiguille doit passer contre le toit de la bouche et l'œsophage. Gravity devrait guider l'aiguille vers le bas sans rencontrer de résistance. S'il ya une resistanCE, retirez l'aiguille et recommencer. Gag de l'animal et le réflexe d'avaler peut être déclenché lors de l'insertion. Cependant, il devrait y avoir aucune résistance ou de l'animal haletant. Il est important de s'assurer que l'animal respire, lorsque l'aiguille est en place en vérifiant le mouvement des narines et la poitrine.
5. Poussez lentement le piston de la seringue pour distribuer le volume de la dose.
6. Retirer délicatement l'aiguille gavage au même angle et la voie que la voie qu'il a été inséré dans l'œsophage.
7. Retour à l'animal de sa cage et la respiration de surveiller et de comportement pendant 5 ~ 10 minutes.

IV. Imagerie in vivo

Nous utilisons les sciences de la vie étrier pour surveiller le comportement des cellules injectées dans la cavité intrabursal. Des expériences utilisant ce système ont généralement un délai de 4 ~ 16 semaines à partir du moment de l'implantation tumorale.

1. Préparer la solution de D-luciférine (substrat de la luciférase de luciole) par dissolution de 5 ~ 20 mg dans 1 ml de PBS et le filtrage par membrane de 0,22 um pour la stérilisation.
2. Charge de la chambre de l'induction en tournant sur les deux l'oxygène et le gaz isoflurane. Tourner sur le flux de gaz à la chambre d'induction seulement. Le débit d'isoflurane est maintenue à un faible niveau jusqu'en animaux sont prêts à être imagé.
3. Vérifiez le numéro d'identification de l'animal et la santé observables. Placez l'animal dans la chambre de l'induction chargé de gaz isoflurane.
4. Retirez les animaux de la chambre lorsque l'animal semble être anesthésié. Livrer 200 uL d'une solution de luciférine préparée par injection IP à l'aide d'aiguille 30 G. Il est important d'enregistrer le temps d'injection afin de maintenir le temps entre l'injection cohérente luciférine et la performance d'imagerie à travers l'étude.
5. Placez le dos de l'animal luciférine-injecté dans la chambre d'induction.
6. Réglez le système d'imagerie pour les paramètres appropriés. Soyez sûr d'initialiser le système avant l'acquisition de l'image premier animal.
7. Eteignez le débit de gaz de la chambre de l'induction et tourner sur le flux de gaz dans la chambre de l'imagerie.
8. Placez la dorsale des animaux anesthésiés ou face ventrale en place. Veillez à placer le nez de l'animal dans un cône de nez de maintenir l'induction anesthésique approprié. Assurez-vous que l'animal est dans le "point de la grille d'intérêt" comme indiqué par l'illumination verts.
9. Fermez la porte de la chambre et d'acquérir l'image au moment opportun. Le temps peut être déterminé par la cinétique.
10. Retirez les animaux de la chambre de l'imagerie et le replacer dans sa cage. Surveiller la récupération des animaux tel que décrit dans «Injection Intrabursal".

Résultats Représentant V.

Figure 1. Imagerie in vivo des cellules tumorales ovariennes dans un modèle murin orthotopique. OVCAR5 cellules exprimant la luciférase ont été injectées dans intrabursally ovaire droit et imagés au fil du temps. Les images ont été prises 13 (à gauche), 17 (milieu) et 22 (droit) jours après l'injection en utilisant le système d'imagerie IVIS spectre. Face dorsale est montré dans le panneau supérieur et la face ventrale est en bas du panneau. Notez que la propagation des cellules tumorales péritonéale 22 jours suivant l'injection.

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par les soins Fox Chase Cancer Center animaux institutionnel et le Comité d'utilisation.

Discussion

Cancer de l'ovaire est la principale cause de décès parmi tous les cancers gynécologiques ^1. Le taux élevé de mortalité de cette maladie est largement due à son diagnostic tardif et le manque de fiabilité des méthodes de diagnostic ^2. Par ailleurs, la chimiothérapie conventionnelle se heurte souvent à la chimiorésistance et de rechute de cancer ^3. Par conséquent, de nouvelles thérapies est nécessaire pour cibler efficacement cette maladie. Dans le développement de nouvelles thérapies ciblant le cancer ovarien humain, il est essentiel d'élaborer un modèle animal représentatif.

Un modèle animal orthotopique a des avantages sur des modèles de xénogreffe classiques (par exemple sous-cutanée ou intrapéritonéale injections de cellules tumorales) en ce que 1) il reproduit le site principal de la formation de tumeurs, 2) il représente le site commun de métastases, et 3) il fournit aux cellules tumorales interagir avec microenvironnement approprié ^{4, 5, 6, 7, 8.} Les rongeurs ont une membrane unique, la bursite qui entoure l'ovaire et est continue avec l'oviducte. Cette anatomie unique de rongeurs permet l'injection de cellules tumorales ovariennes orthotopique. Intrabursally injecté des cellules tumorales ovariennes comportement similaire à la maladie humaine, ce croissant au sein de la membrane et la diffusion intrabursal dans la cavité péritonéale à mesure que progresse la tumeur. L'injection de cellules exprimant de façon stable luciférases ou des protéines fluorescentes permet également le suivi de comportement des cellules tumorales en temps réel. Bioluminescentes et / ou la technologie d'imagerie fluorescente permet aux cellules tumorales d'image à plusieurs reprises sur une période prolongée de temps et la croissance tumorale étude, la distribution, et la régression non-invasive de manière ^{9, 10, 11.}

En établissant le modèle orthotopique, il est essentiel de supprimer rapidement l'aiguille de la bourse lors de l'injection. Retrait brutal des phoques aiguille de ponction et empêche la fuite de cellules injectées. Toutefois, dans le même temps, le mouvement doit être doux de ne pas déchirer la bourse. Si une fuite se produit pendant l'injection, il peut causer des cellules à des semences dans l'abdomen et potentiellement confondre l'étude, soit prématurée propager à l'extérieur de l'ovaire. Dans ce cas, l'animal en question devraient être enregistrées et suivies pour le développement de sites tumoraux multiples dans le péritoine avant le traitement ou bien éliminés des analyses ultérieures. Avant de procéder à un gavage oral, il est essentiel de vérifier la longueur du tube de gavage en mesurant de la pointe de la tête de l'animal à la dernière côte. Il est utile de marquer le tube au nez de l'animal et ne pas passer le tube au-delà de cette marque. L'insertion du tube au-delà de cette marque peut entraîner une perforation de l'estomac. Déterminer la longueur du tube est particulièrement important avec de jeunes animaux ou des animaux pesant moins de 20 g. Lors de l'insertion de l'aiguille de gavage dans l'œsophage, il devrait y avoir aucune résistance ou de lutte de l'animal. Il est important de ne pas administrer la solution ou la suspension trop vite car cela peut conduire au reflux et ensuite livrer le volume dose inexacte, ainsi que l'ajout de stress pour l'animal. Pour obtenir des résultats comparables d'imagerie, de temps en temps, il est souhaitable de maintenir le temps cohérent entre l'injection de substrat de la luciférase et d'imagerie. Le laps de temps peut être déterminé en prenant des séries d'images après l'injection du substrat et d'observer la cinétique des signaux. Développement d'un modèle de souris orthotopique de cancer de l'ovaire, l'administration orale de médicaments, et l'imagerie in vivo sont les techniques nécessaires à une meilleure compréhension du développement et de propagation du cancer de l'ovaire et d'évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques qui pourraient éventuellement améliorer les résultats des patients atteints de cette maladie mortelle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796