في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Summary

النماذج الحيوانية مثلي من تكرار الاصابة بسرطان المبيض أفضل الأمراض التي تصيب البشر ، وبالتالي تعزيز فهمنا لتطور السرطان واستجابة الورم للعلاج. نموذج الفأر حقنة من intrabursal luciferase ، معربا عن الخلايا السرطانية في المبيض. إدارة العلاج خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم. ويتم رصد نمو الورم عن طريق

Abstract

ويمثل سرطان الإنسان أفضل واستجابة للعلاج في النماذج الحيوانية مثلي. وتصف هذه الورقة وضع نموذج الفأر مثلي الاصابة بسرطان المبيض ، وعلاج سرطان الفم عن طريق تقديم الأدوية ، ومراقبة سلوك الخلايا السرطانية في الاستجابة للعلاج المخدرات في الوقت الحقيقي باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي. في هذا النموذج مثلي ، يتم تطبيق خلايا ورم المبيض معربا عن luciferase موضعيا عن طريق حقنها مباشرة في الجراب الماوس حيث تم تضمينه كل المبيض. عند حقن D - luciferin ، ركيزة من luciferase يراعة ، luciferase - معربا عن خلايا توليد الإشارات تلألؤ بيولوجي. تم الكشف عن هذه الإشارة من قبل نظام التصوير في الجسم الحي ، ويتيح وسيلة غير الغازية لرصد نمو الورم ، والتوزيع ، والانحدار في الحيوانات الفردية. إدارة المخدرات عن طريق الفم بالتزقيم يسمح لحجم الجرعة القصوى 10 مل / كغ من وزن الجسم ليتم تسليمها مباشرة إلى المعدة ويشبه تسليم المخدرات في العلاجات السريرية. ولذلك ، وصفت تقنيات هنا ، ووضع نموذج الفأر مثلي الاصابة بسرطان المبيض ، والتسليم عن طريق الفم من المخدرات ، والتصوير في الجسم الحي ، هي مفيدة لفهم أفضل للسرطان المبيض الإنسان وتحسين العلاج وسوف تستهدف هذه الأمراض.

Protocol

أولا إعداد خلايا ورم في المبيض

1. نمو المبيض خطوط الخلايا السرطانية معربا عن luciferase في الثقافة. يمكن أن تكون مصادر luciferase اليراع ، Renilla ، أو الأنواع الأخرى. ويمكن أيضا التعبير عن الخلايا البروتينات الفلورية استخدامها. لهذه التظاهرة التي قمنا استخدام الخلايا السرطانية خط المبيض ، OVCAR5 ، معربا عن يراعة luciferase.
2. حصاد الخلايا باستخدام تقنية زراعة الخلايا الروتينية.
3. الحفاظ على تعليق خلية (10،000 خلية / ميكرولتر) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الجليد حتى وقت الحقن.

II. Intrabursal حقن

هذا الإجراء يتطلب مساعدة من شخص ثان. وتجرى جميع العمليات الجراحية تحت ظروف معقمة. وهذا يشمل ارتداء الملابس الجراحية واستخدام الأدوات الجراحية المعقمة ، المحاقن ، والإبر.

1. يعد حل مخدر عن طريق خلط 3 مل من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / مل) ، و 1.6 مل من هيدروكلوريد زيلازين (100 ملغ / مل) ، و 1.5 مل من آسيبرومازين (10 ملغ / مل) ، و 20 مل من كلوريد الصوديوم 0.9 ٪.
2. الاختيار رقم هوية الحيوان والصحة ملاحظتها. تخدير الحيوانات مع تخدير الكيتامين - زيلازين - آسيبرومازين أعدت عن طريق الحقن (IP) داخل الصفاق مع حجم الجرعة من 8 ~ 9 وزن الجسم مل / كغ (BW).
3. تأكد من أن الحيوان في إطار عادي مقبول من التخدير عن طريق إجراء قرصة أخمص القدمين أو الأصابع مع ملقط لالكفوف الحيوان الخلفيتين. إذا كان هناك دواسة منعكس ، انتظر عادي أعمق من التخدير حتى الحيوان لا يستجيب لهذا الإجراء.
4. يكمن الجانب الظهري الحيوان حتى على شاش معقم مع رئيسها تواجه بعيدا وذيله يواجه نحو لكم. وتقع نقطة من شق إلى اليسار أو اليمين من خط الوسط وفوق المبيض. حلق أو الرطب الفراء مع الكحول 70 ٪ عند نقطة شق.
5. رفع الجلد باستخدام الملقط المبللة وإجراء شق صغير مع مقص في موقف ظهراني إنسي ومباشرة فوق لوحة المبيض الدهون. ينبغي للسادة الدهون المبيض تكون مرئية تحت سطح الجدار البريتوني. وسادة دهنية يمكن التعرف بسهولة من خلال لونه أبيض على النقيض من نسيج وردي داكن المحيطة به.
6. رفع بلطف بطانة جدار البريتوني وإحداث شق صغير كما هو موضح أعلاه (5).
7. وضع الشاش المعقم غارقة في المياه المالحة في خط الوسط بجوار شق. تحديد موقع لوحة المبيض الدهون واسحبه برفق خارج والباقي وضعها على الشاش. تحقيق الاستقرار في المبيض قبل لقط لوحة الدهون مع مقطع البلدغ. في ظل موقف تشريح ، المجهر المبيض من أجل إتاحة الفرصة لإدخال الإبرة (30 قياس ، G) في منحنى نبيب قناة البيض مما يؤدي إلى الجراب. عندما يتم إدخال الإبرة في الموضع الصحيح ، يجب أن تكون مرئية تحت الجراب.
8. دفع برفق المكبس من حقنة لحقن 5 ميكرولتر من تعليق خلية بين الجراب والمبيض في حين يتم وضع الحقنة في موقع الحقن. هذه الخطوة تتطلب شخصين. شخص واحد يدفع المكبس في حين أن الشخص الآخر يحتفظ موضع الإبرة. إزالة الإبرة بسرعة لاغلاق هذا الموقع ولكن يكفي ثقب بلطف لا المسيل للدموع ونبيب الجراب. ينبغي أن الجراب يبدو أن منتفخة قليلا مع الحقن.
9. الافراج عن لوحة الدهون من البلدغ كليب واستبدالها بلطف الجهاز التناسلي والدهون مرة أخرى سادة في التجويف البريتوني. برفق إغلاق جدار الجسم عن طريق سحب البطانة العلوية البريتوني خلال أقل البطانة. إغلاق الجلد بدبابيس الجراحية أو مقاطع الجرح.
10. مكان يستعيد الحيوان في قفصه ، وتوفير مصدر آمن لتجنب الحرارة وانخفاض حرارة الجسم تسريع الانتعاش. مراقبة معدل التنفس وسهولة ، وعودة قوة العضلات ، والقدرة على التحرك طواعية. هذه كلها مؤشرات جيدة للتقدم نحو الانتعاش. ويمكن إزالة المواد الغذائية الأساسية أو مقاطع الجرح (7) أو أكثر بعد الجراحة يوما.

III. بالتزقيم الإدارة عن طريق الفم

1. استخدام إبر G 18 ~ 20 بالتزقيم أو أنبوب تغذية مع طرف مدورة. يجب أن تكون أطول إبرة بالتزقيم لا يتجاوز المسافة من طرف رئيس الحيوان للالضلع الأخير.
2. التحقق من عدد الحيوانات تحديد والصحية يمكن ملاحظتها. القفا بلطف الحيوانية استيعاب الجلد فوق الكتفين مع الإبهام والأصابع. يجب أن يكون حازما ضبط النفس بما يكفي لأطرافه الصدارة إلى أن تمتد إلى كل جانب والخروج من الطريق. وينبغي أن الحيوان لا يكون قادرا على فهم في الإبرة.
3. سحب الرأس إلى الخلف برفق مع الحيوان السبابة الخاص ، والتي تشكل خط مستقيم من خلال الرقبة والمريء. دعم ظهر الحيوان مع الداخل من الإبهام.
4. بلطف وبدون قوة ، تضاف إبرة بالتزقيم على جانبي الفم وعلى اللسان. في اقتراح واحد على نحو سلس ، وينبغي أن تمر الإبرة ضد سقف الفم وأسفل المريء. وينبغي أن خطورة توجيه الإبرة أسفل دون مقاومة الاجتماع. إذا كان هناك أي resistanم ، وإزالة الإبرة والبدء من جديد. قد تكون نجمت هفوة الحيوان ومنعكس البلع أثناء الإدراج. ومع ذلك ، ينبغي أن يكون هناك أي مقاومة أو يلهث من الحيوان. فمن المهم للتأكد من أن الحيوان عندما يتنفس الإبرة في مكانها عن طريق فحص حركة الخياشيم والصدر.
5. دفع المكبس ببطء من المحقنة إلى الاستغناء عن حجم الجرعة.
6. إزالة الإبرة بلطف بالتزقيم في نفس الزاوية والمسار والطريقة التي تم إدراجها أسفل المريء.
7. عودة إلى قفص الحيوان ومراقبة التنفس والسلوك لمدة 5 دقائق 10 ~.

رابعا : في مجال التصوير فيفو

نستخدم الفرجار علوم الحياة لمراقبة سلوك الخلايا حقنها في جوف intrabursal. التجارب التي تستخدم هذا النظام وعادة ما يكون الإطار الزمني لمدة 4 أسابيع 16 ~ من وقت زرع الورم.

1. يعد حل مد luciferin (الركيزة luciferase من يراعة) عن طريق إذابة 5 ~ 20 ملغ في 1 مل من برنامج تلفزيوني والتصفية من خلال الغشاء 0.22 ميكرون للتعقيم.
2. تهمة تحريض للغرفة عن طريق تشغيل كل من الأوكسجين وغاز isoflurane. بدوره على تدفق الغاز الى حجرة تحريض فقط. المحافظة على معدل التدفق isoflurane عند مستوى منخفض حتى الحيوانات جاهزة للتصوير.
3. التحقق من عدد الحيوانات تحديد والصحية يمكن ملاحظتها. وضع الحيوانات في غرفة تحريض المكلفة isoflurane الغاز.
4. إزالة الحيوان من الغرفة عند الحيوان يبدو أن تخدير. توريد 200 ميكرولتر من محلول luciferin أعدت عن طريق الحقن IP باستخدام إبرة G 30. من المهم أن تسجل الوقت من الحقن من اجل الحفاظ على الوقت متناسقة بين luciferin الحقن والأداء والتصوير طوال فترة الدراسة.
5. مكان الظهر luciferin حقن الحيوان الى غرفة التعريفي.
6. تعيين نظام التصوير لالإعدادات المناسبة. تأكد من تهيئة النظام قبل الحصول على صورة أول حيوان.
7. إيقاف تدفق الغاز الى حجرة تحريض وبدوره على تدفق الغاز الى غرفة التصوير.
8. ضع الظهرية تخدير الحيوانات أو حتى الجانب البطني. تأكد من وضع الأنف الحيوانات في مخروط الأنف السليم للحفاظ على تحريض التخدير. تأكد من أن الحيوان في "نقطة من شبكة المصالح" كما يتبين من الإضاءة الخضراء.
9. إغلاق باب الغرفة والحصول على صورة في الوقت المناسب. ويمكن تحديد الوقت عن طريق حركية.
10. إزالة الحيوان من غرفة التصوير ووضعه مرة أخرى في قفصه. رصد الانتعاش الحيوانات كما هو موضح في "حقن Intrabursal".

خامسا نتائج الممثل

الشكل 1. فيفو في مجال التصوير من الخلايا السرطانية في المبيض نموذج الفأر مثلي. تم حقن الخلايا معربا عن OVCAR5 luciferase intrabursally في المبيض الأيمن وتصويرها على مر الزمن. وقد اتخذت صورا 13 (يسار) و 17 (وسط) و 22 (يمين) بعد أيام من الحقن باستخدام التصوير الطيف IVIS النظام. يظهر الجانب الظهري في لوحة العلوي والجانب البطني هو في اللوحة السفلى. علما بأن انتشار الخلايا السرطانية البريتوني 22 يوما بعد الحقن.

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها فوكس تشيس للسرطان العناية المركز الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام.

Discussion

سرطان المبيض هو السبب الرئيسي للوفاة بين جميع الأورام الخبيثة الجهاز التناسلي للمرأة ^1. ارتفاع معدل الوفيات من هذا المرض يرجع الى حد كبير على التشخيص في وقت متأخر وعدم وجود طرق التشخيص الموثوق ^2. وعلاوة على ذلك ، والعلاج الكيميائي التقليدي غالبا ما واجه مقاومة كيميائية والانتكاس من السرطان ^3. ولذلك ، مطلوب رواية المداواة لاستهداف هذا المرض بفعالية. في تطوير علاج جديد يستهدف الإنسان بسرطان المبيض ، من المهم جدا لتطوير نموذج حيواني التمثيلية.

نموذج حيواني مثلي له مزايا أكثر من النماذج التقليدية طعم أجنبي (على سبيل المثال تحت الجلد أو الحقن داخل الصفاق من الخلايا السرطانية) في ان 1) وهي منقولة عن موقع الورم الرئيسي للتشكيل ، 2) أنه يمثل موقع مشترك للالانبثاث ، و 3) أنه يوفر لخلايا الورم تفاعل مع المناسبة المكروية ^{4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8.} القوارض وغشاء فريدة جرابي الذي يحيط المبيض والمستمر مع قناة البيض. هذا التشريح فريدة من القوارض يسمح حقن الخلايا السرطانية orthotopically المبيض. Intrabursally حقن الخلايا السرطانية المبيض تتصرف مشابهة لمرض الإنسان ، وبالتالي تزايد داخل غشاء intrabursal ونشر في التجويف البريتوني مع تقدم الورم. حقن الخلايا معربا عن luciferases ستابلي أو البروتينات الفلورية كما يسمح السلوك تتبع الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي. Bioluminescent و / أو الفلورسنت تكنولوجيا التصوير يجعل من الممكن للخلايا الورم الصور مرارا وتكرارا على مدى فترة ممتدة من الزمن ، ودراسة نمو الورم ، والتوزيع ، والانحدار في غير الغازية نحو ^{9 ، 10 ، 11.}

في إنشاء نموذج مثلي ، فمن الأهمية بمكان بسرعة لإزالة الإبرة من الجراب على الحقن. ازالة الاختام المفاجئ للموقع ثقب إبرة ، ويمنع تسرب حقن الخلايا. ومع ذلك ، في الوقت نفسه ، ينبغي للحركة أن يكون لطيف لا لتمزيق الجراب. إذا تسرب يحدث أثناء الحقن ، ويمكن أن يسبب الخلايا إلى البذور في البطن ويحتمل أن نخلط الدراسة ، أي قبل الأوان ينتشر خارج المبيض. في هذا الحدث ، ينبغي أن يسجل الحيوان محددة واتباعها لتطوير مواقع متعددة في ورم في الغشاء البريتوني قبل المعالجة أو التخلص بدلا من التحليلات اللاحقة. قبل أداء بالتزقيم عن طريق الفم ، فمن الأهمية بمكان للتحقق من طول الأنبوب من خلال قياس بالتزقيم من غيض من رأس الحيوان للضلع الماضي. ومن المفيد للاحتفال أنبوب في الأنف والحيوان لا تمرير أنبوب الماضي هذه العلامة. ويمكن إدخال أنبوب الماضية نتيجة هذه العلامة في ثقب في المعدة. تحديد طول الأنبوب له أهمية خاصة مع الحيوانات الأصغر سنا أو الحيوانات وزنها أقل من 20 جرام. عند إدخال الإبرة بالتزقيم أسفل المريء ، ويجب أن يكون هناك أي مقاومة أو النضال من الحيوان. فمن المهم عدم إعطاء الحل أو تعليق سريع جدا لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى ارتداد وتسليم في وقت لاحق غير دقيقة حجم الجرعة ، وكذلك إضافة الإجهاد على الحيوان. لتحقيق نتائج مماثلة التصوير من وقت لآخر ، فمن المستحسن أن تبقي في الوقت متناسقة بين حقن الركيزة luciferase والتصوير. يمكن تحديد الفترة الزمنية من خلال اتخاذ سلسلة من الصور بعد الحقن الركيزة ومراقبة حركية الاشارات. وضع نموذج الفأر مثلي الاصابة بسرطان المبيض ، والتسليم عن طريق الفم من المخدرات ، والتصوير في الجسم الحي والتقنيات اللازمة لفهم أفضل للتطور وانتشار سرطان المبيض وتقييم الأنظمة العلاجية التي قد الرواية في النهاية الى تحسين نتائج المريض مع هذا المرض الفتاك.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796