Summary
इस प्रोटोकॉल में हम एक घुलनशील प्रोटीन डिटर्जेंट जटिल के रूप में अभिव्यक्ति, solubilization, और एक recombinantly व्यक्त झिल्ली प्रोटीन, MexB की शुद्धि, का प्रदर्शन. MexB अवसरवादी बैक्टीरियल रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa से बहुऔषध प्रतिरोध झिल्ली ट्रांसपोर्टर है.
Abstract
बहुऔषध प्रतिरोध (एमडीआर), एक कैंसर कोशिका या रोगज़नक़ की क्षमता के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से असंबंधित विरोधी कैंसर दवाओं या एंटीबायोटिक दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रतिरोधी हो, सार्वजनिक स्वास्थ्य में वर्तमान गंभीर समस्या है. इस बहुऔषध प्रतिरोध काफी हद तक ऊर्जा निर्भर दवा तपका पंप के कारण है. पंप बाहरी माध्यम में कैंसर रोधी दवाओं या एंटीबायोटिक दवाओं को निष्कासित, उनके एक जहरीले सीमा से नीचे intracellular एकाग्रता कम. हम Pseudomonas aeruginosa, एक अवसरवादी जीवाणु रोगज़नक़ है कि चोट या बीमारी के कई प्रकार के के साथ रोगियों में संक्रमण का कारण बनता है में बहुऔषध प्रतिरोध का अध्ययन कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, जलता है या सिस्टिक फाइब्रोसिस, और भी इम्युनो - समझौता कैंसर, डायलिसिस, और प्रत्यारोपण के रोगियों में. पी. में प्रमुख एमडीआर तपका पंप aeruginosa त्रिपक्षीय परिसरों एक आंतरिक झिल्ली प्रोटॉन दवा (RND) antiporter, एक बाहरी झिल्ली चैनल (OMF), और एक periplasmic linker (MFP) प्रोटीन 1-8 शामिल हैं. RND और OMF प्रोटीन transmembrane प्रोटीन होते हैं. Transmembrane प्रोटीन सभी प्रोटीन का 30% से अधिक बनाने के लिए और मौजूदा दवा लक्ष्य का 65% हैं. हाइड्रोफोबिक transmembrane डोमेन प्रोटीन जलीय बफर में अघुलनशील बनाते हैं. इससे पहले एक transmembrane प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है है, यह आवश्यक है के लिए बफर शर्तों युक्त एक हल्के साबुन है कि प्रोटीन एक प्रोटीन डिटर्जेंट परिसर (PDC) 9-11 के रूप में solubilized सक्षम मिल. इस उदाहरण में, हम एक RND प्रोटीन, पी. का उपयोग aeruginosa MexB transmembrane ट्रांसपोर्टर, प्रदर्शित करने के लिए कैसे एक transmembrane प्रोटीन का एक फार्म रीकॉम्बीनैंट व्यक्त करने के लिए, यह डिटर्जेंट का उपयोग solubilize, और फिर शुद्ध प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों. यह सामान्य विधि अभिव्यक्ति, शुद्धि, और कई अन्य recombinantly व्यक्त झिल्ली प्रोटीन के solubilization लागू किया जा सकता है. प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों बाद में जैव रासायनिक या biophysical एक्स - रे क्रिस्टल संरचना निर्धारण या crosslinking अध्ययन सहित लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. दिन 1:
Pseudomonas aeruginosa से MexB pFB101 द्वारा इनकोडिंग है. MexB जीन पी. से परिलक्षित किया गया था aeruginosa जीनोमिक डीएनए और NdeI और XhoI pET30b + वेक्टर के प्रतिबंध साइटों में सम्मिलित. का निर्माण hexahistidine सी - टर्मिनल टैग शामिल हैं.
- प्लाज्मिड ई. परिणत करने के लिए प्रयोग किया जाता है कोलाई C43 (DE3) 12 तनाव, और transformants लेग अगर 30 kanamycin स्नातकीय एमएल / युक्त पर चढ़ाया जाता है.
2. दिन 2: ओवरनाइट संस्कृति:
- शाम में, 4 एक्स 3 एमएल लेग 30 kanamycin स्नातकीय एमएल / युक्त संस्कृतियों ताजा transformant कालोनियों से inoculated हैं. वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों की एक जमे हुए पर्म से inoculated किया जा सकता है है.
इन छोटे संस्कृतियों एक रोलर पर 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर उगाए जाते हैं.
3. 3 दिन: 6 लीटर संस्कृति के बढ़ते:
- सुबह में, रात भर संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए 150 एमएल लेग 30 kanamycin स्नातकीय एमएल / युक्त टीका लगाना. 37 ° एक प्रकार के बरतन सी संस्कृति हो जाओ.
- दोपहर में, छोटे संस्कृति का उपयोग करने के लिए x 6 1L 2XYT 30 स्नातकीय / एमएल Fernbach बोतल में kanamycin युक्त मीडिया को टीका लगाना. (1:40 कमजोर पड़ने के लिए संस्कृति के प्रति 25 एमएल). 37 में संस्कृतियों ग्रो डिग्री सेल्सियस वे 1.5 घंटे के बारे में 0.4-0.6 के एक आयुध डिपो 600, तक पहुँचने जब तक
- जब संस्कृतियों उचित घनत्व तक पहुँचने, 0.5 एमएल 1M IPTG जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित. सभी बोतल वापस प्रकार के बरतन में रखो और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस रातोंरात बढ़ने के लिए जारी है.
4. 4 दिन: फसल काटने वाले कक्ष और शुद्ध प्रोटीन:
- Protease inhibitors के रूप में बफर समाधान के लिए, DNase, और lysozyme जोड़ें: सेल resuspension बफर के 50 एमएल, 10 मिलीग्राम (0.1 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) DNaseI, एक पूरा EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोली lysozyme की और एक चुटकी जोड़ने . झिल्ली resuspension बफर के 60 एमएल करने के लिए, एक protease अवरोध करनेवाला गोली जोड़ने. झिल्ली resuspension बफर के एक और 50 एमएल करने के लिए, एक protease अवरोध करनेवाला गोली जोड़ने. बर्फ पर सभी तीन समाधान रखें.
- संस्कृतियों में बड़े पैमाने पर अपकेंद्रित्र 30 मिनट ५००० rpm के लिए कोशिकाओं फसल अपकेंद्रित्र.
- 100 एमएल सेल resuspension बफर (50 मिमी झपकी, 7.0 पीएच, 300 मिमी NaCl, 2 मिमी 2 MgCl, 1 पूरा EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोली, 0.1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं lysozyme के, चुटकी) में कोशिकाओं Resuspend
- १२००० साई (762 गेज दबाव) पर एक फ्रांसीसी दबाव सेल के माध्यम से सेल समाधान दो बार दर्रा. एक बोतल में सेल lysate लीजिए बर्फ पर ठंड रखा.
- SS34 अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए सेल lysate स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए 10,000 rpm पर 4 सेल मलबे को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र ° सी में एक एस एस 34-रोटर.
- ध्यान से Ti647.5 ultracentrifuge एक ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हटा दें. 4C पर 40,000 rpm पर 50 मिनट अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- गोली है, जो कोशिका झिल्ली लगभग में, शामिल हैं Resuspend. झिल्ली resuspension बफर के 25 एमएल (50 मिमी झपकी, 7.0 पीएच, 300 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, एक पूरा EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोली).
- 4 में 50 मिनट के लिए एक Ti647.5 रोटर में 40,000 rpm पर एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण झिल्ली निलंबन डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 25 एमएल झिल्ली resuspension बफर में धोया झिल्ली गोली (50 मिमी झपकी, 7.0 पीएच, 300 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, एक पूरा EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला गोली) resuspend.
5. टीएम प्रोटीन Solublization:
- Resuspended झिल्ली (25 एमएल के बारे में) करने के लिए, 6 एमएल 10% (अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता = 2% DDM) DDM रॉक 4 में मिश्रण डिग्री सेल्सियस 2 घंटे के लिए. जोड़ें
- 40,000 rpm पर 4 बजे 40 मिनट के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस Ti647.5 रोटर अघुलनशील प्रोटीन से अलग घुलनशील प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों में. सतह पर तैरनेवाला, जो MexB प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों शामिल सहेजें.
6. IMac:
- कूपन धातु आत्मीयता resuspension बफर में equilibrated मोती के साथ उच्च गति स्पिन से प्राप्त सतह पर तैरनेवाला मिक्स. 4 में एक रोलर पर 1hr लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- एक गुरुत्व प्रवाह स्तंभ शरीर में घोल डालो और के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
- IMac बाध्यकारी और धो बफर के 20 एमएल (10 स्तंभ संस्करणों) (50 मिमी झपकी, पीएच 7, 300 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 0.2% DDM) के साथ स्तंभ धो
- IMac elution बफर (50 मिमी झपकी, 7.0 पीएच, 300 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 250 मिमी imidazole, 0.2% DDM) के साथ प्रोटीन Elute.
- Elution भिन्न के 15 μL नमूने ले लो, 15 μL polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण के लिए 2X एसडीएस नमूना बफर के साथ प्रत्येक मिश्रण. Microcentrifuge में 30sec स्पिन. एक 10% polyacrylamide एसडीएस जेल नमूने का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक अंश में राशि और MexB की शुद्धता का अनुमान है.
- पूल MexB प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों और एक स्पिन concentrator में उन्हें 4 पर ध्यान केंद्रित युक्त भिन्न डिग्री सेल्सियस सावधान रहो कि प्रोटीन इस पर वेग नहीं करता हैtep.
7. जेल निस्पंदन स्तंभ:
- एक Superose 24 एमएल चल बफर (50 मिमी झपकी, 7.0 पीएच, 300 मिमी NaCl, 5% ग्लिसरॉल, 0.2 बीटा octylglucoside%) के साथ 12 HL 30/10 स्तंभ पूर्व संतुलित है, और एक फ्लैट आधारभूत के लिए प्रतीक्षा.
- Akta सिस्टम लोड हो रहा है पाश चल रहे बफर के साथ कुल्ला.
- प्रोटीन यह कॉलम को लागू करने से पहले एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.
- प्रोटीन समाधान के 240 μL स्तंभ पर ऊपर की एक प्रोटीन एकाग्रता के साथ 5mg / एमएल लोड.
- भागो 1.5 बफर के स्तंभ मात्रा (36 एमएल), 0.25 एमएल भिन्न इकट्ठा. Elution मात्रा के 15 एमएल - MexB प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों 10 के आसपास एक चोटी के रूप में elute चाहिए.
- पीक भागों की 5 μL नमूने ले लो. 2X एसडीएस नमूना बफर के साथ प्रत्येक नमूने 01:01 मिक्स. एक 10% polyacrylamide जेल पर नमूने का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक अंश में राशि और MexB की शुद्धता का अनुमान
- पूल शुद्ध MexB युक्त भिन्न है.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 जमा iMac और जेल निस्पंदन स्तंभ से स्तंभ में व्यक्ति भिन्न से स्तंभ भिन्न के साथ एक polyacrylamide जेल शामिल हैं. जेल निस्पंदन स्तंभ के बाद Coomassie दाग polyacrylamide जेल के द्वारा शुद्ध प्रोटीन प्रकट होता है. चित्रा 2 जेल निस्पंदन स्तंभ से प्रोटीन डिटर्जेंट जटिल eluting के मुख्य शिखर दिखा स्तंभ से एक ट्रेस शामिल हैं. MexB प्रोटीन की औसत उपज लगभग 2 2XYT संस्कृति के 6 लीटर प्रति मिलीग्राम है.
चित्रा 1. एसडीएस पृष्ठ MexB पीडीसी की शुद्धि की जेल 1 लेन, आण्विक वजन मार्करों. 2, iMac भिन्न जमा. 3-7, जेल निस्पंदन स्तंभ भिन्न.
चित्रा 2. MexB प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों (PDC) के लिए जेल निस्पंदन परिणाम के उदाहरण .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रतिरोध, आयन परिवहन, संचार सेल सेल, पुटिका परिवहन, सेलुलर संरचना के रखरखाव, और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधियों, बहुऔषध के अलावा, प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली में एम्बेडेड रहे हैं शामिल है. Transmembrane प्रोटीन ज्ञात प्रोटीन का 30% से अधिक बनाने के लिए और आज का उपयोग में दवाइयों के बहुमत के लिए लक्ष्य कर रहे हैं. अनुचित या transmembrane प्रोटीन की तह गतिविधि सिस्टिक फाइब्रोसिस और मधुमेह सहित महत्वपूर्ण आनुवांशिक रोगों, के लिए सीसा. Transmembrane प्रोटीन का विशाल महत्व के बावजूद, वहाँ अब तक कम घुलनशील प्रोटीन के लिए की तुलना में उनकी संरचनाओं और आणविक तंत्र के बारे में जाना जाता है. हाइड्रोफोबिक दृश्यों की उपस्थिति यह मुश्किल व्यक्त करने के लिए और इन प्रोटीनों की बड़ी मात्रा को अलग बनाने के लिए और उन्हें कई जैव रासायनिक और संरचनात्मक तरीकों के लिए आग रोक बनाता कर सकते हैं.
यह एक घुलनशील प्रोटीन डिटर्जेंट जटिल प्रोटोकॉल के रूप में अभिव्यक्ति, डिटर्जेंट और एक एमडीआर झिल्ली प्रोटीन के solubilization शुद्धि का प्रदर्शन किया. इन विधियों कई recombinantly व्यक्त transmembrane प्रोटीन के लिए कुछ संशोधन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. परिणामस्वरूप शुद्ध प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों में घुलनशील हैं और crystallization परीक्षण के लिए एक्स - रे crystallographic संरचना निर्धारण के लिए और अन्य biophysical या जैव रासायनिक liposomes या crosslinking अध्ययन में पुनर्गठन सहित लक्षण, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
शुद्धीकरण प्रक्रियाओं के दौरान, यह महत्वपूर्ण है सावधान रहना है कि प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों स्पिन एकाग्रता चरणों के दौरान बाहर नहीं वेग. विभिन्न तरीकों में भी जैसे एक बहुत छोटे से कॉलम और छोटे elution मात्रा के साथ iMac कदम दोहरा जेल निस्पंदन कदम है, पहले या बाद में PDC ध्यान केंद्रित करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और Biomolecular विज्ञान के लिए सोसायटी से CJJ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
