Summary
I detta protokoll visar vi uttrycket lösningsgörande, och rening av recombinantly uttryckt membranprotein, MexB som ett lösligt protein rengöringsmedel komplex. MexB är en multidrogresistensgenen membran transportör från de opportunistiska bakteriell patogen Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Multidrogresistensgenen (MDR), möjligheten för en cancercell eller patogen att vara resistent mot ett brett spektrum av strukturellt och funktionellt oberoende cytostatika eller antibiotika, är ett aktuellt allvarligt problem i folkhälsan. Detta multidrogresistensgenen beror till stor del energiberoende pumpar efflux. Pumparna utvisa cytostatika eller antibiotika i externt medium, sänka sina intracellulära koncentrationen under en giftig tröskel. Vi studerar multidrogresistensgenen i Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk bakteriell patogen som orsakar infektioner hos patienter med många typer av skador eller sjukdom, till exempel brännskador eller cystisk fibros, och även i Immuno äventyras-cancer, dialys, och patienter transplantation. De stora MDR effluxpumpar i P. aeruginosa är tre parter komplex består av ett inre membran proton-läkemedel antiporter (RND), ett yttre membran kanal (OMF), och en periplasmic länkare protein (MFP) 1-8. Den RND och OMF proteiner transmembrane proteiner. Transmembrana proteiner utgör mer än 30% av alla proteiner och 65% av nuvarande målproteiner. Den hydrofoba transmembrana domäner gör de proteiner olösliga i vattenlösning buffert. Innan en transmembranös proteinet kan renas är det nödvändigt att hitta buffert villkor som innehåller ett milt diskmedel som gör att proteinet ska solubilized som ett protein rengöringsmedel komplex (PDC) 9-11. I detta exempel använder vi en RND protein, P. aeruginosa MexB transmembrana transportör, för att visa hur man uttrycker en rekombinant form av en transmembranös protein, löses den med diskmedel och sedan rena proteinkomplex rengöringsmedel. Denna allmänna metod kan tillämpas på uttrycket, rening och lösningsgörande många andra recombinantly uttryckt membranproteiner. Proteinet tvättmedel komplex kan senare användas för biokemiska och biofysiska karakterisering inklusive röntgen kristallstruktur beslutsamhet eller studier crosslinking.
Protocol
1. Dag 1:
MexB från Pseudomonas aeruginosa kodas av pFB101. Den MexB gen förstärktes från P. aeruginosa genomiska DNA och sätts in i NdeI och XhoI platser begränsning av pET30b + vektor. Det konstruera innehåller en C-terminal hexahistidine tag.
- Den plasmiden används för att omvandla E. coli stam C43 (DE3) 12, och transformants är pläterade på LB-agar innehåller 30 ug / ml kanamycin.
2. Dag 2: Övernattning kulturer:
- På kvällen är 4 x 3 ml LB kulturer innehåller 30 ug / ml kanamycin ympas från färska transformanten kolonier. Alternativt kan kulturer ympas från en frusen perm.
Dessa små kulturer odlas på ett berg vid 37 ° C över natten.
3. Dag 3: Växande 6 Liter kulturer:
- På morgonen använder natten kulturer att inokulera 150 ml LB innehåller 30 ug / ml kanamycin. Odla kulturen vid 37 ° C på en shaker.
- På eftermiddagen använder den lilla kulturen att inokulera 6 x 1L 2XYT media som innehåller 30 ug / ml kanamycin i Fernbach kolvar. (Använd 25 ml per kultur för en 1:40 spädning). Växer de kulturer vid 37 ° C tills de når en OD 600 av 0,4-0,6, ca 1,5 timmar
- När kulturer når rätt densitet, framkalla protein uttryck genom att tillsätta 0,5 mL 1M IPTG. Sätt alla kolvar tillbaka i shaker och fortsätter att växa dem vid 30 ° C över natten.
4. Dag 4: Skörd Cells och rena Protein:
- Lägg proteashämmare, DNAse, och lysozym i buffertlösningar som följer: till 50 ml av cell resuspension buffert, tillsätt 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml slutlig koncentration), 1 Komplett EDTA-fri proteashämmare tablett, och en nypa av lysozym . Till 60 ml membran resuspension buffert, tillsätt 1 tablett proteashämmare. Till en annan 50 ml membran resuspension buffert, tillsätt 1 tablett proteashämmare. Håll alla tre lösningar på is.
- Centrifugera de kulturer 30 min 5000 rpm i storskaliga centrifug för att skörda cellerna.
- Resuspendera cellerna i 100 ml cell resuspension buffert (50 mm NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Komplett EDTA-fri proteashämmare tablett, 0,1 mg / ml DNAse jag nypa av lysozym)
- Pass cellen lösningen två gånger genom en fransk press cell vid 12.000 psi (762 övertryck). Samla cellen lysat i en flaska förvaras kallt på is.
- Överför cellen lysat till SS34 centrifugrör och centrifugera att ta bort cellfragment i 30 min vid 10.000 rpm vid 4 ° C i en SS-34 rotorn.
- Ta försiktigt bort supernatanten i Ti647.5 ultracentrifugen rör. Centrifugera 50 min vid 40.000 rpm vid 4C. Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten, som innehåller cellens membran, i ca. 25 mL membran resuspension buffert (50 mm NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, en komplett EDTA-fri proteashämmare tablett).
- Överför membranet fjädring till ett rent centrifugrör och centrifugera vid 40.000 rpm i en Ti647.5 rotor för 50 minuter vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera tvättas membranet pelleten i 25 ml membran resuspension buffert (50 mm NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, en komplett EDTA-fri proteashämmare tablett).
5. TM Protein Solublization:
- Till återsuspenderade membran (ca 25 ml), lägg till 6 ml 10% DDM (slutlig diskmedel koncentration = 2% DDM) Rock blandningen vid 4 ° C i 2 timmar.
- Centrifugera blandningen vid 40.000 rpm i 40 minuter vid 4 ° C i Ti647.5 rotorn att separera lösliga proteinkomplex rengöringsmedel från olösliga proteiner. Spara supernatanten som innehåller MexB proteinkomplex tvättmedel.
6. IMac:
- Blanda supernatanten från den höga hastigheten snurra med talongen Pärlor Metall affinitet till jämvikt i resuspension buffert. Inkubera i 1 timme på en berg vid 4 ° C.
- Häll suspensionen i en självfall kolumn kropp och kasta passera.
- Tvätta kolonnen med 20 ml (10 kolumn volymer) av iMac Bindning och tvättbuffert (50 mm NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% DDM)
- Eluera proteinet med iMac eluering buffert (50 mm NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 250 mm imidazol, 0,2% DDM).
- Ta 15 mikroliter prov av elueringen fraktioner, blanda med vardera 15 mikroliter 2X SDS prov buffert för analys genom polyakrylamidgelelektrofores. Spin 30 sek i mikrocentrifug. Analysera prover på en 10% polyakrylamid SDS gel att uppskatta mängden och renhet MexB i varje fraktion.
- Pool de fraktioner som innehåller MexB proteinkomplex tvättmedel och koncentrera dem i en spin anrikningsverk vid 4 ° C. Var försiktig så att proteinet inte fälls ut på denna sTEP.
7. Gelfiltrering Kolumn:
- Pre-jämvikta en Superose 12 HL 30/10 kolonnen med 24 mL löpande buffert (50 mm NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% beta-octylglucoside), och vänta på en lägenhet baslinje.
- Skölj Akta teleslingan lastning med löpande buffert.
- Filtrera proteinet hjälp av en spruta filter innan det till kolumnen.
- Fyll på upp till 240 mikroliter av proteinet lösningen i kolonnen, med ett protein koncentration av upp till 5 mg / ml.
- Kör 1,5 kolumnen volymer (36 ml) av buffert, samla in 0,25 ml fraktioner. Den MexB protein tvättmedel komplexen bör eluera som en topp på cirka 10 - 15 ml av eluering volym.
- Ta 5 mikroliter prov på toppen fraktioner. Blanda varje prov 1:1 med 2X SDS prov buffert. Analysera prover på en 10% polyakrylamidgel att uppskatta mängden och renhet MexB i varje fraktion
- Pool de fraktioner som innehåller rena MexB.
8. Representativa resultat:
Figur 1 innehåller en polyakrylamidgel med poolade kolumnen fraktioner från iMac kolonnen och enskilda fraktioner från gelfiltrering kolumnen. Efter gelfiltrering kolumnen proteinet verkar rent av Coomassie färgade polyakrylamidgelelektrofores. Figur 2 innehåller ett spår från gelfiltrering kolumnen visar de viktigaste toppen av proteinet tvättmedel komplexa eluerar från kolonnen. Den genomsnittliga avkastningen på MexB protein är ca 2 mg per 6 liter 2XYT kultur.
Figur 1. SDS-PAGE gel av rening av MexB PDCs. Lane 1, molekylvikt markörer. 2, Poolade IMAC fraktioner. 3-7, gelfiltrering kolumnen fraktioner.
Figur 2. Exempel på resultat gelfiltrering för MexB proteinkomplex rengöringsmedel (PDC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förutom multidrogresistensgenen, många viktiga cellulära aktiviteter, inklusive jontransport, cell-cell kommunikation, vesikler transporter, underhåll av cellstruktur, och värd-patogen interaktioner, innebär proteiner som är inbäddade i cellmembranet. Transmembrana proteiner utgör över 30% av de kända proteiner och är målen för de flesta läkemedel som används idag. Felaktig fällbara eller aktivitet av transmembrana proteiner leda till viktiga genetiska sjukdomar, inklusive cystisk fibros och diabetes. Trots den stora betydelsen av transmembrana proteiner finns det mycket mindre känt om deras strukturer och molekylära mekanismer än för lösliga proteiner. Förekomsten av hydrofoba sekvenser kan göra det svårt att uttrycka och isolera stora mängder av dessa proteiner och gör dem eldfasta till många biokemiska och strukturella metoder.
Detta protokoll visade uttrycket, tvättmedel lösningsgörande och rening av ett MDR membranprotein som ett lösligt protein rengöringsmedel komplex. Dessa metoder kan användas med vissa ändringar för många recombinantly uttryckt transmembrane proteiner. Den resulterande renat protein diskmedel komplex är lösliga och kan användas för kristallisering försök med röntgenkristallografisk strukturbestämning och för andra biofysiska och biokemiska karakterisering, inklusive beredning i liposomer eller studier crosslinking.
Under reningsförfaranden, är det viktigt att vara noga med att protein tvättmedel komplex inte fälls ut under stegen spin koncentration. Olika metoder kan också användas för att bidra till att koncentrera PDC före eller efter gelfiltrering steg, till exempel upprepa IMAC steg med en mycket liten kolumn och små urlakningsvolymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet har finansierats med bidrag till CJJ från National Science Foundation och Sällskapet för biomolekylär Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SDS sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT media | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB media | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml tubes | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon metal affinity resin | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 column | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon centrifugal concentrator | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Syringe filter | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach flasks | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | ||
| Akta system | GE Healthcare | ||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 rotor and tubes with caps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
