Summary
Insonazione di microbolle è una strategia promettente per l'ablazione del tumore al ridotto potere acustico medie nel tempo, così come per la somministrazione mirata di terapie. Lo scopo del presente studio è quello di sviluppare strategie di ultrasuoni a bassa dovere ciclo pulsante e nanovettori per massimizzare non ablazione termica microvascolare e la consegna a carico sottocutaneo C6 gliomi.
Abstract
Stiamo sviluppando mini-invasiva delle microbolle di contrasto agente approcci terapeutici in cui si controllava la permeabilizzazione e / o ablazione del microcircolo variando parametri ecografici impulsi. In particolare, stiamo verificando se tali approcci possono essere utilizzati per il trattamento di tumori maligni al cervello attraverso la somministrazione di farmaci e l'ablazione microvascolare. Gli studi preliminari sono stati condotti per determinare se mirati droga cuscinetto consegna delle nanoparticelle può essere facilitato dalla distruzione mediata ecografia di "composite" agenti di consegna composta da 100nm poli (lattide-co-glicolico) (Plaga) nanoparticelle che vengano rispettati albumina microbolle sgusciate . Indichiamo questi agenti come microbolle-nanoparticelle agenti composito (MNCAs). Quando mirati per via sottocutanea C6 gliomi con gli ultrasuoni, abbiamo osservato un immediato 4,6 volte più elevata di consegna delle nanoparticelle nei tumori Monica trattati per tumori trattati con microbolle co-somministrato con nanoparticelle e un aumento di 8,5 volte rispetto non trattati tumori. Inoltre, in molte applicazioni di cancro, crediamo possa essere auspicabile per effettuare la consegna farmaci mirati in collaborazione con ablazione del microcircolo tumorale, che porterà ad ipossia tumorale e l'apoptosi. A tal fine, abbiamo testato l'efficacia della non theramal cavitazione indotta ablazione microvascolare, dimostrando che questo approccio provoca una riduzione del tumore perfusione, l'apoptosi, inibizione della crescita significativa, e necrosi. Presi insieme, questi risultati indicano che i nostri ultrasuoni mirati approccio ha il potenziale per aumentare l'efficacia terapeutica con la creazione di necrosi tumorale attraverso l'ablazione microvascolari e / o contemporaneamente migliorare il carico di droga in gliomi.
Protocol
1. Microbolle di produzione
- Per preparare microbolle albumina (MB), posto una soluzione 1% di albumina sierica in soluzione fisiologica in un pallone con una coltre di gas (octafluoropropane) sopra la fase acquosa. Sonicare brevemente la soluzione (30 sec), con un disintegratore ultrasuoni dotata di un esteso ½ "sonda al titanio. Questa formulazione è simile a Optison (GE Heathcare), che viene fornito in una vasta concentrazione di 0,5-1,2 x 10 9 MB / ml. Determinare diametro medio MB con un Coulter Multisizer contatore. albumina Il diametro medio MB utilizzati in questo studio è stato 1.93um ± 1.63um.
- Per fabbricare MB lipidi, preparare una dispersione acquosa di 1 mg / ml di polietilenglicole stearato-40 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e 2 mg / ml fosfatidilcolina distearoyl (Avanti Polar Lipids, alabastro, AL) e sonciate come precedentemente descritto (1.1) con il gas decafluorobutane. Determinare diametro medio MB con un contatore Multisizer Coulter. Il diametro medio MB lipidi utilizzati in questo studio è stato 2.01um ± 1.29um.
2. Nanoparticelle di fabbricazione
- Questi metodi sono stati adattati da acqua in olio in acqua tecnica di emulsione evaporazione dei solventi descritto da Davda (2002) e Chappell (2008).
- Preparare un 2% di poli (alcole vinilico) PVA soluzione sciogliendo 20 gr di PVA in 1000 ml di acqua deionizzata (DI). Lasciare la soluzione per sciogliere completamente su un piatto mescolare durante la notte. Soluzione centrifugare a 1000 rpm per 10 minuti e filtrare con un filtro 0.22μm sterile per rimuovere ogni residuo PVA non disciolti.
- Per fabbricare albumina di siero bovino (BSA) caricati poli (lattico-co-glicolico acido) (Plaga) nanoparticelle (NP), sciogliere 180mg di uncapped 85:15 Plaga a 6 ml di cloruro di metilene (MC) in un flaconcino di vetro scintillazione. Vortex MC / Plaga soluzione per 2 minuti.
- Sciogliere payload desiderato (15 mg di BSA) in 1,5 ml di PBS. Aggiungere il PBS / BSA soluzione in due parti per la Plaga / MC soluzione con vortex intermittente. Soluzione posto in ghiaccio per 5 minuti e sonicare a 45W per 120 secondi.
- Aggiungere il MC / Plaga / carico utile / soluzione PBS per 24ml del 2% PVA, in due porzioni con vortex intermedi.
- Ponendo la soluzione in ghiaccio per 5 minuti e sonicare a 45W per 120.
- Mescolare l'emulsione NP per 12 ore su un piatto mescolate in una cappa aspirante per consentire l'evaporazione di MC e NP stabilizzazione.
- Centrifugare la sospensione per 25 minuti a 20.000 rpm a 4 ° C due volte per isolare e rimuovere i residui NP PVA. Risospendere il pellet in 8 ml di acqua deionizzata e centrifugare per 10 minuti a 1000 rmp a 4 ° C per isolare la popolazione di 100 nm di NP.
- Isolare il supernatante e flash congelare a -80 ° C. liofilizzare il campione congelato per 48 ore. Conservare le particelle liofilizzato in un essiccatore a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo.
3. Composito di consegna del veicolo di fabbricazione (Protocollo Adattato da VisEn Note Chimica)
- Conversione di VivoTag680 alle funzionalità di superficie carbossi
- Combina un flaconcino di VivoTag680 con 50 ml di 1.0 M HEPES, pH 7 e anidride succinico (2,5 mg, 25 ìmol) in 25 microlitri di DMSO. Aggiungere 50 ml di NaOH 1,0 M a questa soluzione, accuratamente mescolato, permettono la soluzione di reagire per 2 ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Purificare le particelle con Bio-Rad Biogel (P100, medio) ad eluizione con 0,1 M MES tampone, pH 6,0. Raccogliere la fascia verde.
- Attivazione di carbossi-modificato VivoTag680
- Combina carbossi-modified VivoTag680 ottenuto in 0,1 M MES, pH 6, con 1 mg di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimmide (EDC) e 2,2 mg di N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS). Lasciare agire per 2 ore a temperatura ambiente.
- Purificare particelle attivato da agente attivante eccesso (EDC) con gel filtrazione utilizzando Bio-Rad Biogel (P100, medio) ad eluizione con 0,1 M MES, pH 6.0 e raccogliere la fascia verde. Immediatamente coniugato le particelle attivati per ammine contenenti molecole (ad esempio BSA-caricato nanoparticelle). Lasciare che la soluzione di reagire per 2 ore a temperatura ambiente. Amine NP coniugati sono stati purificati da eccesso di EDC per centrifugazione a 20.000 rpm per 60min a 4 ° C, versando il sopranatante dopo centrifugazione e risospensione in 0,1 tampone MES.
- Fermo qui per fabbricare VivoTag680 NP tag per gli studi di consegna della droga.
- Coniugazione di carbossi-modificato PLGA-BSA-VivoTag680 nanoparticelle (NP680) per microbolle Albumina
- Combina NP680 ottenuto in 0,1 M MES, pH 6 con 1 mg di 1-etil-3-(3 dimetilamminopropil)-carbodiimmide (EDC) e 2,2 mg di N-idrossi-sulfosuccinimide (Sulfo-NHS). Lasciare che la soluzione di reagire per 1 ora a temperatura ambiente.
- Purificare nanoparticelle attivato da eccesso di EDC per centrifugazione a 20.000 rpm per 60min a 4 ° C, versando il sopranatante dopo la centrifugazione. Risospendere nanoparticelle di 0,1 tampone MES.
- Lavare MB albumina tre volte in degasato BSA PBS per rimuovere l'eccesso di soluzione.
- Immediatamente coniugato le particelle attivati per ammine contenenti molecole (ad esempio microbolle albumina). Lasciare NP680 soluzione di reagire per 2 ore a temperatura ambiente. Purificare NP680 microbolle coniugati (Monica) dal NP680s non legati mediante lavaggio tre volte con PBS degasato.
- Determinare la concentrazione di MNCAs utilizzando un contatore Coulter.
4. Tumore del modello
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati in base ad un protocollo di animali approvati dalla University of Virginia e cura degli animali Comitato Usa.
- Linea C6 ratto Giloma delle cellule tumorali è stato fornito dal Dr. Jason Sheehan di UVA (Charlottesville, VA).
- Linea di cellule è stato testato per garantire le cellule sono state micoplasma libero.
- Mantenere la linea cellulare in F-12K Miscela di nutrienti integrato con siero di cavallo 16%, 3% di siero fetale bovino (FBS) e 1% Pen-Strep (Gibco, USA) a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Inoculare C57BLJ6/Rag1 topi (Jackson) con 3 x 10 6 C6 cellule tumorali Giloma sospesi in 300 ml di PBS per via sottocutanea nella arti posteriori di sinistra. Lasciare tumore di crescere per 12 giorni per raggiungere un diametro massimo di 8-10mm.
5. In applicazione ad ultrasuoni Vivo
- Anestetizzare i topi con un intraperitoneale (IP) iniezione combinazione di cloridrato di ketamina (60 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (0,1 mg / kg di peso corporeo) prima del trattamento.
- Preparare una manutenzione anestetico di cloridrato di ketamina (20 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (0,3 mg / kg di peso corporeo). Somministrare, se necessario.
- Cannulate la vena della coda di ogni animale per la via endovenosa (IV) la somministrazione di un MB, MB / NP o soluzione di Monica.
- Misure perfusione del tumore
- IV infondere una soluzione MB lipidi (1x10 8 MB / g di peso corporeo in 0,3 ml di soluzione fisiologica 0,9%) ad una velocità di 15μl/min con una pompa di infusione continua (Harvard Apparatus PHD 2000; Harvard Apparatus, Holliston, MA).
- Un Acuson Sequoia 512 ecografia sistema (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA), equipaggiato con un 8 13 MHz lineare 15L8 sonda è stato utilizzato in questo studio per quantificare la perfusione del tumore maggiore contrasto. Coppia la sonda 15L8 al tumore con una base d'acqua gel per ultrasuoni (Parker Laboratori Aquasonic 100; Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ). Eseguire la scansione del tumore in B-Mode per ottenere il miglior aereo di imaging.
- In contrasto sequenza di impulsi (CPS) modalità, acquisire un video continuo la cattura del segnale microbolle intensità 5 secondi prima e 20 dopo, ad alta ampiezza di impulsi "burst" ad un frame rate di 13Hz. Ripetere le misurazioni in quattro piani d'immagine.
- Attendere dieci minuti per infondere MB albumina e iniziare il trattamento terapeutico a bassa frequenza per permettere MB lipidi per eliminare dalla circolazione.
- Ultrasuoni trattamento terapeutico
- Dieci minuti dopo le misurazioni della perfusione del tumore (5,3) coppia un diametro di 0,75''1 trasduttore MHz sfocata (A314S; Panametrics, Waltham, MA) per la pelle sopra il tumore fianco. IV infondere un MB albumina (1 x10 5 MB / g di peso corporeo in 0,3 ml di soluzione fisiologica 0,9%), MB / NP (1 x10 5 MB / g e 0,2 NP ug / g di peso corporeo in 0,3 ml di soluzione fisiologica 0,9%) o Monica soluzione (1 x10 5 MNCAs / g di peso corporeo in 0,3 ml di soluzione fisiologica 0,9%).
- Trattamento di consegna della droga
- Insonate per 60 minuti con la sequenza "1-Burst" impulsi (5.4.2.2), nel corso di una infusione continua di NP, co-iniezione di MB e NP, o MNCAs (5.4.1).
- Il "1-Burst" sequenza di impulsi consiste di 100 consecutivi sinusoidi 1 MHz (duty cycle = 0,00002), ognuno di 1V picco-picco di ampiezza da un generatore di forme d'onda (AFG-310, Tektronix, Inc., Beaverton, OR). Amplificare il segnale della forma d'onda da un 55 dB RF con un amplificatore di potenza (ENI 3100LA; Electronic Industries di navigazione, Richardson, TX).
- Il trattamento ablativo
- Identico al 5.4.2.1, tuttavia insonate con il "5-Burst-medio" o "5-Burst - estesa" sequenza di impulsi
- Il "5-Burst-Media" sequenza di impulsi è costituito da 5000 1 sinusoidi MHz (duty cycle = 0,005) ognuno di 1V picco-picco di ampiezza. Il "5-Burst-Exteneded" sequenza di impulsi è costituito da 10.000 sinusoidi 1 MHz (duty cycle = 0,01) ciascuno di 1V picco-picco di ampiezza.
- Nel corso del tempo di controllo della temperatura esperimento tumore con l'inserimento di un ago sonda termocoppia (Omega di tipo T, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2 centimetri nel tumore. Record misure di temperatura ogni cinque minuti.
- Ripetere le misurazioni perfusione del tumore, come descritto in 5.3 dieci minuti dopo il trattamento terapeutico.
6. Quantificazione perfusione del tumore
- Utilizzando il programma CPS sulla Sequoia, accedere alla modalità ACQ. Seleziona °regione e di interesse che comprende il volume totale del tumore. Curve di recupero perfusione verrà generato la forma y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001; Yeh 2004) che sono adatti ai dati CPS. Valutare β, una misura relativa della velocità dei globuli rossi, pre-trattamento e post-trattamento.
- Esportare file CPS per analisi off-line. Convertire i dati in file avi. Rompere i file avi in frame-by-frame sequenze di immagini. Utilizzando Compaq Visual Fortan, o un pacchetto software simile, generare un tempo media di immagine di tutti i fotogrammi dal impulsi distruttivi a 8 secondi dopo l'impulso distruttivo.
- Per determinare perfusi zona del tumore, utilizzando il software ImageJ, applicare una soglia di 247 a 8-morso di tempo media di immagine CPS e quantificare i pixel percentuale maggiore all'interno del volume del tumore. Sovrapporre la corrispondente immagine B-mode con il tempo di media immagine thresholded di definire con precisione nell'area tumorale.
- Media la percentuale perfuso zona per un minimo di quattro clip CPS di ottenere una superficie finale perfuso in un punto dato momento per un tumore particolare.
- Prendere il prodotto della zona perfusi per cento (6,4) e β (.1) per determinare il flusso relativo tumore del sangue.
7. Biodistribuzione nanoparticelle nel tumore
- Dodici giorni prima del trattamento con fluorescente topi posto NP su una dieta a basso alfasprot (Harlan, Indianapolis IN) per ridurre autofluorescenza causati dalla normale del mouse chow quando imaging.
- Shave il sito di imaging (a fianco del fegato) per rimuovere tutti i capelli.
- Eliminare i peli residui con un agente chimico di rimozione dei capelli, come Nair.
- Risciacquare rimozione di tutti i residui chimici o capelli una bruciatura chimica si possono verificare.
- Topi immagine sul sistema FMT (VisEn Medica) prima del trattamento e le ore 0, 1, 4, e 24 dopo il trattamento, come descritto al punto 5.4.2.
- Prima di immagini topi anestetizzare con un'iniezione combinazione IP di cloridrato di ketamina (60 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (0,1 mg / kg di peso corporeo). Del mouse posto sulla cartuccia di imaging. Acquisire immagini di riflettanza in luce bianca e modalità fluorescenti. Effettuare fluorescenti immagini tomografiche nel canale VT680.
- Impiegare la FMT software per generare ricostruzioni in 3D dei dati di immagini utilizzando una equazione normalizzata Nato. Dopo la ricostruzione, selezionare i volumi di interesse (VOI è), disegnando una regione di interesse (ROI) in tutti e 3 i piani d'immagine (X, Y, Z). Un valore medio fluorescenti e il volume totale e la concentrazione VOI fluorocromo, a causa fluorescente tag BSA NP, verrà generato per VOI è che comprende i piedi e il fegato.
8. Tasso di crescita del tumore
- Valutare il volume del tumore prendendo misurazioni giornaliere con i calibri digitali. Calcolare i volumi del tumore con una approssimazione ellissoide; V = 1 / 6 abc π. Dove a, b, ec sono i diametri massimi del tumore misurati in tre piani ortogonali.
9. Trattamento del tumore e analisi
- Sette giorni dopo gli animali eutanasia trattamento. Cannulate il ventricolo sinistro e del sangue exsanguinate con 10 ml del 2% eparinizzato CaCl 2 Tris Buffer (0,68 mM) perfusione, seguita da 10ml Tampone Tris CaCl 2 (0,68 mM), ciascuno per 10 minuti a 100 mmHg.
- Perfusione-fix dei tessuti con un infuso di paraformaldeide 4% in PBS (4 ° C) per 10 minuti a 100 mmHg. Lasciare campione per fissare per 60 minuti.
- I campioni d'accisa, incorporare in paraffina, e tagliare in 5 micron sezioni.
- Eseguire serie ematossilina-eosina per valutare alterazioni istologiche che possono essersi verificati a seguito di esposizioni a ultrasuoni.
- Per rilevare cellule apoptotiche, utilizzare un terminale transferasi deoxynucleotidyl deossiuridina mediata etichettatura trifosfato nick fine (TUNEL) saggio (ApoptTag kit, Intergen Co., Norcross, GA, USA).
10. Rappresentante Risultati
1. Nanoparticelle di fabbricazione (2,0)
- Se questo protocollo è preformato correttamente NP sarà di forma sferica, come determinato dalla scansione elettronica microcopia (SEM), e hanno una distribuzione gaussiana attorno 100nm, come determinato da tecniche di diffusione della luce. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 1.
2. Consegna farmaci mirati (5.4.1)
- Sulla base di studi pubblicati effettuati nel nostro laboratorio (Canzone 2002, Chappell 2008) e risultati non pubblicati presenti nella figura 2, ultrasuoni risultati distruzione delle microbolle nella consegna migliorata di nanoparticelle intravascolare al tessuto tumorale. Abbiamo anche dimostrato che la nostra Monica risultati di consegna tecnica nella consegna nanoparticelle accentuata immediatamente dopo il trattamento.
3. Ablazione del tumore (5.4.3)
- Abbiamo dimostrato che la prolungata distruzione ultrasuoni microbolle, a cicli di lavoro relativamente bassa (0,005-0,01), comporta l'ablazione meccanica delmicrocircolo tumorale e regressione della crescita tumorale. Se questo protocollo è eseguita correttamente si dovrebbe aspettare variazioni di (i) tasso di crescita tumorale (Figura 3), (ii) l'emodinamica del tumore (Figura 4), (iii) zona necrotica e (iv) l'apoptosi.
Caratterizzazione Figura 1. Plaga di nanoparticelle cuscinetto BSA. (A) Immagine SEM di nanoparticelle opportunamente costruite. (B) Immagine SEM di nanoparticelle impropriamente fabbricato.
Figura 2. (A) Fluorescenza-mediata tomografia (FMT) immagini di ultrasuoni trattati (in alto) e di controllo trattati (in basso) per via sottocutanea gliomi immediatamente dopo il trattamento con un MNCAs, in cui le nanoparticelle (NP) stanno dando i 680 segnali di fluorescenza si sovrappongono in scala di grigi planare eccitazione luminosa immagine.
Figura 3. Rappresentante fold change nella crescita dei tumori seguenti insonazione microbolle con i cinque-burst protocollo esteso pulsante.
Figura 4. B-Mode (A, C) e contrast-enhanced ecografia (B, D) le immagini di un tumore sottocutaneo C6 glioma in un topo. Nell'immagine pretrattamento iniziale (A) il limite di tumore per lo più ipoecogene è stata tracciata in blu. Tempo medio di miglioramento dopo l'iniezione endovenosa di un mezzo di contrasto è mostrata in (B) pretrattamento. Post-trattamento, prima dell'iniezione di contrasto, il tumore è ancora per lo più ipoecogena (D). Dopo l'iniezione di contrasto, non c'è miglioramento significativamente inferiore nel tumore.
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Discussion
Passaggi critici
Cannulazione della vena del mouse coda:
L'iniezione endovenosa nella vena della coda del mouse può essere una procedura impegnativa. Tuttavia, un catetere venoso coda può migliorare notevolmente la probabilità di una iniezione di successo. Per rendere il catetere, piegare ripetutamente avanti e indietro da 25 gauge finché non si rompe dal mozzo. Inserire l'estremità smussata nella parte finale del PE 20 tubi e sigillare la connessione con la colla di silicio. Per preparare il catetere per incannulazione, collegare una siringa caricata con soluzione fisiologica eparinata 1% al Cather e infondere liquidi nello spazio morto del catetere. Posizione di un mouse anestetizzato su un lato quindi la vena caudale laterale è in vista. Dilatare la coda con acqua calda (105 ° - 110 ° F). Inserire l'ago nella vena. Se il sangue di successo di solito entrare il catetere. Verificare che l'ago è in vena deselezionando la vena con una piccola quantità di soluzione salina. Fissare il catetere in posizione con del nastro prima di collegare la siringa nella pompa per infusione.
Nanoparticelle Resuspension:
Le nanoparticelle possono aggregare liofilizzazione seguente. Particelle Risospendere in PBS, brevemente ripetutamente vortice e sonicare (10 sec) in un bagno d'acqua sonora. E 'fondamentale per sospendere di nuovo correttamente il campione liofilizzato. Caratterizzano la sospensione con microscopia SEM e le tecniche di scattering di luce a seguito di liofilizzazione e risospensione.
Le modifiche possibili:
In termini di regolazione del protocollo di fabbricazione di nanoparticelle, BSA serve come surrogato della droga e possono essere scambiati per una moltitudine di agenti terapeutici. A seconda della solubilità dell'agente terapeutico, le nanoparticelle possono essere fabbricati come un olio in emulsione acqua o come olio in acqua in emulsione di olio. L'efficienza di carico e il rilascio di un agente terapeutico di Plaga NP, può essere regolato anche notevolmente se lo si desidera. Per aumentare l'efficienza di carico, aumentare il peso / peso di carico di droga in vettori polimero attraverso l'ottimizzazione dei parametri di fabbricazione NP. Per adattare il tasso di rilascio di un agente terapeutico, variare il tasso di idrolisi costante attraverso variazioni di peso molecolare e la lattico / glicolico rapporto di Plaga. Dal talioring sia l'efficienza di carico e velocità di rilascio di agenti terapeutici, e da Plaga NP, la concentrazione desiderata locale può essere consegnato al tessuto. In termini di regolazione del protocollo di recapito, i fattori più importanti sono il grado di distruzione ultrasuoni Monica e permeabilizzazione microvascolare. E 'stato riportato che l'albumina microbolle sgusciate hanno una emivita di 1,3 ± 0,69 minuti (media ± DS) (Optison 2008). Ipotizziamo che l'infusione continua l'agente e l'applicazione degli ultrasuoni prolungata aumenta il grado di permeabilizzazione microvasi. Da tempo di trattamento sempre più il nostro obiettivo è di accrescere transitoriamente permeabilizzazione del microcircolo.
Il non-termici protocollo ablazione meccanica può essere regolata modificando la concentrazione MB o la pressione di picco ultrasuoni. Si prevede che l'aumento della concentrazione MB e / o ecografia picco di pressione aumenterà il grado di danni al sistema vascolare del tumore.
Applicazioni:
Stiamo sviluppando tecniche per abbassare la potenza acustica richiesta dal transcranica ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) per raggiungere l'effetto terapeutico desiderato.
In parte a causa di complicazioni associate con il trattamento attraverso il cranio e l'importanza del tessuto circostante, ablazione termica dei tessuti del tumore con gli ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) non ha ancora raggiunto diffuso utilizzo come opzione terapeutica per il cancro al cervello. Conclusioni preliminari dei primi tre pazienti di un treno clinici hanno indicato profonda trattamento HIFU cerebrale focale a risultati sub-ablativo temperature di riscaldamento cranici (McDannold 2009). La chiave del successo di HIFU come trattamento clinico per il trattamento di tumori cerebrali transcranica è la capacità di localizzare la fornitura di energia acustica in una regione ben delineata. La capacità di fornire energia acustica è complicata dalle interfacce osso o aria, come il teschio e le precedenti resezioni chirurgiche, che generano aberrazioni fase e potenza come l'energia ad ultrasuoni si attenua lungo il percorso di propagazione (Tanter 1998). Queste aberrazioni spesso contribuiscono al riscaldamento pre-focale (McDonnald 2009) e cavitazioni nei tessuti sani.
Nel corso degli ultimi anni, l'utilizzo di microbolle per abbassare la potenza acustica di mirate, interruzione reversibile BBB e ablazione del tumore ha attirato molto interesse la ricerca (Hynynen 2001, Sheikov 2004, McDannold 2006a, 2006b, Meairs 2005). McDannold et al. (2006a) hanno dimostrato che l'iniezione intravascolare di microbolle al momento del trattamento HIFU ha comportato una riduzione del 91% nelmedie nel tempo soglia di potenza acustica per i danni meccanici rispetto ai controlli microbolle in cui non erano presenti, mostrando il potenziale per generare lesioni con aumento della temperatura ridotta. La riduzione della soglia termica per la formazione della lesione, a sua volta riduce la probabilità di accumulo di calore nel tessuto bersaglio off o osso. Inoltre, è stato dimostrato che la somministrazione endovenosa di microbolle al momento del trattamento a ultrasuoni risultati transitori, localizzata, aprendo BBB con potenze di circa due ordini di grandezza inferiori a quelle richieste per la formazione della lesione.
E 'l'obiettivo di questo lavoro per sviluppare ultrasuono-microbolle tecniche per abbassare sia la potenza acustica richiesta dal transcranica HIFU e controllare il grado di permeabilizzazione microvascolare. Le due specifiche applicazioni terapeutiche di questo lavoro nel cervello sono la somministrazione di farmaci mirati e non-termici ablazione. I livelli relativi di aumentata permeabilità e ablazione permanente può essere controllato regolando i livelli di potenza acustica a seconda che l'enfasi è sulla somministrazione di farmaci migliorata, permanente ablazione microvascolare, o una combinazione di somministrazione di farmaci e l'ablazione microvascolare permanente. Questa capacità potenziale di controllare come i microvasi rispondere crea l'opportunità di sviluppare forme diverse di nostra strategia di trattamento per specifiche applicazioni terapeutiche transcranica. Crediamo che questo approccio ha il potenziale per trasformare drasticamente come tumori cerebrali vengono trattati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da NIH R01 HL74082, la Fondazione Hartwell, e la Fondazione Chirurgia Focused Ultrasound.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A. Ultrasound microbubblesand the blood brain barrier. Progr Biophys Mol Biol. 93, 354-362 (2007).
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
