Summary
अध्ययन करने के लिए
Protocol
1. सेल संस्कृति
- इससे पहले कि orthotopic इंजेक्शन, संस्कृति MOV1 कैट कोशिकाओं, एक T175 फ्लास्क में DR26 ट्यूमर से व्युत्पन्न, जब तक वे 90% मिला हुआ हैं. इंजेक्शन के प्रति 1 से 5 मिलियन कोशिकाओं है, जो 1 या 2 T175 बोतल की आवश्यकता होगी का उपयोग योजना.
- इंजेक्शन के दिन, कोशिकाओं फसल और सेल एक hemocytometer का उपयोग संख्या का निर्धारण.
- एक बार सेल एकाग्रता निर्धारित किया गया है, गोली 300 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं.
- स्पिन के बाद, कोशिकाओं 0.002 एम EDTA के साथ बाँझ पीबीएस के 10 microliters में 1 लाख resuspend
2. पूर्व सर्जरी
- पहले सर्जरी के लिए 1 मिलियन पीबीएस EDTA के 10 microliters में MOV1 कैट कोशिकाओं के साथ एक 3/10cc इंसुलिन सिरिंज को भरने.
- एक हीटिंग पैड के लिए एक isofluorane anesthetized माउस स्थानांतरण. आँख निर्जलीकरण को रोकने के आँख मरहम जोड़ें. फिर, तुरंत एक नाक शंकु एक isoflurane सर्जरी भर संज्ञाहरण देने vaporizer जुड़े प्रणाली में जानवर के सिर डालने.
- शराब swabs के साथ इंजेक्शन साइट के कीटाणुशोधन के बाद, subcutaneously एक 3/10cc इंसुलिन सिरिंज के साथ 5 मिलीग्राम / ketoprofen, एक पूर्व शल्य एनाल्जेसिक किलो, इंजेक्षन.
- क़ैंची का प्रयोग, जानवरों की पूंछ के आधार पर thoracolumbar जंक्शन से बाएँ dorsum की दुम भाग दाढ़ी. बालों को हटाने क्रीम लागू करने के लिए पूरी तरह से बालों को हटाने के लिए. फिर, एक गीला कागज तौलिया के साथ अधिक हटा दें.
- एक बार बाल हटा दिया गया है, povidone आयोडीन और शराब swabs के साथ मुंडा क्षेत्र बाँझ. फिर, चीरा के आसपास के क्षेत्र एक सर्जिकल कपड़ा जगह है.
3. सर्जरी
- सर्जरी से पहले, 1.5% के isoflurane vaporizer स्तर को समायोजित.
- सत्यापित करें कि जानवर पूरी तरह से पैर पैड pinching द्वारा anesthetized है.
- अगला, त्वचा के नीचे तिल्ली का पता लगाने. फिर शल्य कैंची का उपयोग करते हुए, एक dorsolateral चीरा तिल्ली के ऊपर सही पर 1-2 सेमी लंबे.
- Retroperitoneum काटना. माउस पैड आसपास के अंडाशय में मनाया जाएगा. घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए समझ और वसा पैड माउस अंडाशय के आसपास का पर्दाफाश.
- बाँझ पीबीएस की कुछ बूंदों के साथ हाइड्रेट अंग.
- घुमावदार संदंश का प्रयोग करें काबू करने के लिए, वापस लेना ... स्थिति ... और फिर इंजेक्शन के लिए अंडाशय सुरक्षित
- हालांकि संदंश के साथ मजबूती से अंडाशय लोभी, MOV1 कैट ट्यूमर कोशिकाओं के अंडाशय में 10 microliters इंजेक्षन . एक फर्म पकड़ द्रव regurgitation या रिसाव को रोकने जाएगा.
- तुरंत इंजेक्शन के बाद, संदंश द्वारा exerted तनाव जारी है. अंडाशय में वेध अनायास वापस लेना और बंद हो जाना चाहिए.
- एक absorbable Polyglycolic एसिड एक सुई से जुड़ी सीवन का प्रयोग, रेट्रो - पेरिटोनियम घाव बंद.
- नाक शंकु से पशु रिलीज.
- खींचो त्वचा और ऊतक चिपकने के कुछ बूंदों के साथ dorsolateral घाव किनारों मुहर.
- अंत में, मौखिक रूप से जानवर के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के 100 microliters प्रशासन. तो यह और वसूली के लिए पिंजरे की निगरानी में वापस जगह है. पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं पर एक सप्ताह के लिए पशु रखें.
4. Vivo इमेजिंग में
- MOV1 कैट ट्यूमर कोशिकाओं के orthotopic इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह के vivo इमेजिंग में प्रदर्शन . इमेजिंग चैम्बर के लिए एक isofluorane anesthetized माउस स्थानांतरित द्वारा शुरू करो.
- Isoflurane vaporizer स्तर नीचे 2% करने के लिए मुड़ें.
- Vivo इमेजिंग में इमेजिंग प्रणाली के निर्माता के निर्देशों के अनुसार कार्य करें. इस वीडियो में, Lumina प्रणाली का उपयोग किया जाएगा.
- छवि करने के लिए, जहाँ रहते हैं छवि सॉफ्टवेयर डेस्कटॉप आइकन पर क्लिक करें. फिर, IVIS अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष पर, चुनें "इनिशियलाइज़". साधन सेटिंग्स एक कैमरा सेटिंग्स के अनुरूप हैं
- अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में साधन अधिग्रहण मानकों सेट. प्रतिदीप्ति के लिए, जाँच "प्रतिदीप्त." तस्वीर बॉक्स क्लिक करें प्रत्येक छवि के साथ एक तस्वीर प्राप्त करने के लिए.
- अगला, ऑटो के रूप में जोखिम समय निर्धारित किया है. "पिक्सेल binning या सीसीडी संकल्प" के अंतर्गत, "मध्यम" की जाँच करें. फिर एफ / बंद या एपर्चर के तहत, 2 के मूल्य की जाँच करें. अगला, 535 उत्तेजना फिल्टर और DsRed उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें.
- देखने के क्षेत्र के तहत देखें बी पर एक माउस की छवि के लिए क्लिक करें.
- फिर, अधिग्रहण छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए पर क्लिक करें.
- एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, ब्याज के क्षेत्र, या रॉय, संकेत के उपाय करने के लिए उपकरण का उपयोग करें. संकेत मूल्यों और क्षेत्र जारी माप आइकन पर क्लिक करें.
- अंत में, "सहेजें" पर क्लिक करें उपयोगकर्ता फ़ोल्डर में छवि को बचाने के
- बाद छवियों को बचाया गया है, isoflurane के प्रशासन को रोकने और अपने पिंजरे के लिए माउस वापसी. माउस तुरंत से जगा चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, में vivo विकास एक orthotopic डिम्बग्रंथि के कैंसर के एक गैर इनवेसिव प्रक्रिया का उपयोग कम से कम 3 सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती है.
चित्रा 1 MOV1 कैट कोशिकाओं, या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीबीएस, orthotopically गैर ट्यूमर प्रवण चूहों (सही जानवर और बाएँ जानवर और क्रमशः) के अंडाशय में अंतःक्षिप्त थे vivo इमेजिंग में 2 सप्ताह के बाद प्रदर्शन किया था. प्रतिदीप्ति कैट MOV1 अंडाशय में engrafted कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न उत्सर्जन मापा था और नकारात्मक नियंत्रण माउस से उस के साथ तुलना में.
चित्रा 2 MOV1 कैट डिम्बग्रंथि ट्यूमर के जमे हुए वर्गों. Biotinylated - विरोधी CD4 MAB थपका (काले भूरे रंग) सब्सट्रेट ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (काला तीर) का पता लगाने के द्वारा पीछा के साथ दाग रहे थे. कक्ष मिथाइल हरे रंग के साथ counterstained थे सेल नाभिक (नीला) कल्पना. ट्यूमर कोशिकाओं (लाल तीर) आकृति विज्ञान टी कोशिकाओं से अलग थे. स्लाइड बढ़ाया 40x प्रकट होता है.
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Discussion
सर्जरी और Orthotopic इंजेक्शन
डिम्बग्रंथि बर्सा में Orthotopic इंजेक्शन प्रशिक्षण और परिशुद्धता की मांग. इस प्रकार
- पहली शवों के साथ गरीब शल्य अनुभव व्यवहार के मामले में.
- Preferentially multiparous महिलाओं का उपयोग करें (एक या दो litters) के रूप में वे समय जो इंजेक्शन और वृद्धि अस्तित्व की सुविधा के लिए nulliparous महिलाओं के साथ तुलना से अधिक बड़ा अंडाशय का विकास.
- माउस डिम्बग्रंथि बर्सा के छोटे आकार के कारण, छोटी उपलब्ध सुई आकार का उपयोग दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है.
Vivo इमेजिंग में
- हमेशा के लिए एक संदर्भ का उपयोग एक 1.5 मिलीलीटर ependorf 10 6 से 10 7 MOV1 100 μl में पीबीएस की 1ml करने के लिए कैट कोशिकाओं से भरा ट्यूब जैसे प्रतिदीप्ति, .
- अल्फला मुक्त आहार के साथ पशुओं फ़ीड प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को कम.
- ध्यान से पहले vivo इमेजिंग में पशु पृष्ठभूमि कम दाढ़ी.
महत्व
असुरक्षित पशुओं में तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर है कि orthotopically सुदूर लाल फ्लोरोसेंट डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं (MOV1 कैट) के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं यह syngeneic मॉडल preclinical अध्ययन परमिट प्रारंभिक ट्यूमर के इमेजिंग और चिकित्सा, के लिए उपन्यास रणनीतियों का मूल्यांकन जब बीमारी अभी भी इलाज है, के रूप में अच्छी तरह से के रूप में ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और immunotherapies के vivo निगरानी में.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH अनुदान P01 ऐ 068730 (एस एन सी, एन एस), NIH अनुदान CA016520 / TAPITMAT (एन एस), Claneil फाउंडेशन (एन एस) से निजी धन, और डिम्बग्रंथि बीजाणु FCCC और पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( CA83638 P50) और फॉक्स चेज़ कैंसर केंद्र कोर अनुदान (p30 CA06927) (डीसीसी). लेखकों धन्यवाद ऑप्टिकल / bioluminescence कोर द्वारा निर्देशित स्टेम सेल और xenograft कोर कैंसर पेंसिल्वेनिया के विश्वविद्यालय में डा. जी Danet - Desnoyers द्वारा निर्देशित से पेंसिल्वेनिया, एंथोनी Secreto के विश्वविद्यालय में डॉ. EJ Delikatny सुविधा के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रशिक्षण orthotopic इंजेक्शन तकनीक और सर्जरी पर सहायता के लिए Denada Dangaj / पेंसिल्वेनिया OCRC के विश्वविद्यालय में दक्षिणी नौसेना कमान के लिए केंद्र.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Heating pad | Deltaphase | 39 DP | |
| Povidone pads | Dynarex | 1108 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| 3cc/insulin syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Tissue adhesive | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ oral suspension | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluorane | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| TurboFP635 mammalian vector | Evrogen | FP721 | |
| T175 flasks | cellstar | 660-190 |
References
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