Summary
Para estudar
Abstract
Antecedentes: O câncer de ovário é geralmente diagnosticada em fase avançada, onde a relação caso / fatalidade é alta e assim continua a ser o mais letal de todas as neoplasias malignas ginecológicas entre os EUA as mulheres 1,2,3. Tumores serosos são as formas mais generalizadas de câncer de ovário e de 4,5 a transgênicos Tg-MISIIR-Tag representa o modelo do rato só que espontaneamente se desenvolve este tipo de tumores. Tg-MISIIR-Tag ratos expressar SV40 região transformando sob o controle do mülleriano Substância Inibidora tipo II Receptor (MISIIR) promotor do gene 6. Adicionais linhagens transgênicas foram identificadas que expressam o transgene TAG SV40, mas não desenvolvem tumores de ovário. Não-tumor ratos propensos apresentam vida útil típica de camundongos C57BL / 6 e são férteis. Estes ratos pode ser usado como destinatários aloenxerto singeneicos para células tumorais isoladas de Tg-MISIIR-Tag-DR26 camundongos.
Objetivo: Apesar de imagem do tumor é possível 7, a detecção precoce de tumores profundos é um desafio em animais vivos de pequeno porte. Para habilitar estudos pré-clínicos em modelos animais imunologicamente intacto para o câncer de ovário seroso, descrevemos um modelo de camundongo singeneicos para este tipo de câncer de ovário que permite in vivo de imagens, os estudos do microambiente do tumor e tumor respostas imunes.
Métodos: Nós primeiro derivou uma Tag + mouse linha de células de câncer (MOV1) a partir de um tumor de ovário espontâneas colhidas num 26 semanas de idade, do sexo feminino Tg-DR26 MISIIR-TAG. Então, nós estável transduzidas MOV1 células com TurboFP635 vector Lentivirus mamíferos que codifica Katushka, um mutante vermelho-distante da proteína fluorescente vermelha do mar anemone Entacmaea quadricolor com excitação / emissão em 588/635 nm maxima 8,9,10. Nós ortotopicamente implantado MOV1 Kat no ovário 11,12,13,14 de não-tumor propensas Tg-MISIIR-Tag feminino ratos. Progressão do tumor foi seguido por em imagens ópticas vivo e microambiente do tumor foi analisado por imunohistoquímica.
Resultados: ortotopicamente implantado MOV1 células Kat desenvolveram tumores de ovário seroso. Tumores MOV1 Kat pode ser visualizado por in vivo de imagens até três semanas após o implante (fig. 1) e foram infiltradas com leucócitos, como observado nos cânceres de ovário humano 15 (fig. 2).
Conclusões: Descrevemos um modelo ortotópico de câncer de ovário adequado para a imagem in vivo de tumores no início devido ao alto pH de estabilidade e fotoestabilidade de Katushka em tecidos profundos. Propomos o uso deste novo modelo singeneicos de câncer de ovário seroso para estudos de imagem in vivo e monitoramento de tumor respostas imunes e imunoterapias.
Protocol
1. Cultura de células
- Antes da injeção ortotópico, cultura MOV1 Kat células, derivadas de tumores DR26, em um frasco T175 até que sejam 90% confluentes. Planeja usar 1-5000000 células por injeção, o que exigirá um ou dois frascos T175.
- No dia da injeção, a colheita das células e determinar o número de células usando um hemocitômetro.
- Uma vez que a concentração celular foi determinada, agregar as células por centrifugação por 5 minutos a 300 X g à temperatura ambiente.
- Após a rodada, ressuspender as células de ter 1 milhão em 10 microlitros de PBS estéril com EDTA 0,002 M
2. Pré-operatório
- Antes da cirurgia, encher uma seringa de insulina 3/10cc com 1 milhão de MOV1-Kat células em 10 microlitros de PBS EDTA.
- Transferência de um rato anestesiado com isofluorano uma almofada de aquecimento. Adicionar pomada para evitar a desidratação olho. Então, imediatamente inserir a cabeça do animal em um sistema de cone do nariz ligado a um vaporizador isoflurano para entregar toda a anestesia da cirurgia.
- Após a desinfecção do local de injecção com álcool, por via subcutânea injetar 5 mg / kg de cetoprofeno, um analgésico pré-cirúrgico, com uma seringa de insulina 3/10cc.
- Usando tosquiadeiras, raspar a parte esquerda caudal do dorso da junção tóraco-lombar à base da cauda dos animais. Aplique o creme de depilação para remover completamente o cabelo. Em seguida, retire o excesso com uma toalha de papel molhado.
- Uma vez que o cabelo tenha sido removido, esterilizar a área depilada com iodopovidona e compressas com álcool. Em seguida, coloque uma cortina cirúrgica ao redor da área de incisão.
3. Cirurgia
- Pouco antes da cirurgia, ajustar os níveis de vaporizador isoflurano para 1,5%.
- Verifique se o animal está completamente anestesiado por beliscar a almofada de pé.
- Em seguida, localize o baço sob a pele. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão dorsolateral 1-2 cm de comprimento na parte superior direita do baço.
- Dissecar o retroperitônio. A almofada em torno do ovário do mouse será observado. Use uma pinça curva de compreender e expor a almofada de gordura ao redor do ovário mouse.
- Órgão o hidrato com algumas gotas de PBS estéril.
- Use uma pinça curva de captar, recolher ... posição ... e depois prenda o ovário para injecção
- Enquanto segurando firmemente o ovário com a pinça, injectar 10 microlitros de MOV1 células tumorais Kat no ovário. Um aperto firme irá impedir a regurgitação ou vazamento de fluido.
- Imediatamente após a injeção, liberar a tensão exercida pelo fórceps. A perfuração no ovário deve retrair-se espontaneamente e fechar.
- Usando um fio absorvível de ácido poliglicólico ligado a uma agulha, fechar a ferida retro-peritônio.
- Solte o animal do cone do nariz.
- Esticar a pele e selar as bordas da ferida dorsolateral com algumas gotas de cola de tecido.
- Finalmente, por via oral, administrar 100 microlitros de antibióticos para o animal. Em seguida, coloque-o de volta em sua gaiola e monitor para recuperação. Manter o animal em uso de antibióticos na água de beber por uma semana.
4. In vivo de imagens
- Uma semana após a injeção ortotópico de MOV1 células tumorais Kat, executar em imagem in vivo. Comece por transferir um mouse isofluorano anestesiados para a câmara de imagem.
- Por sua vez o nível de vaporizador isoflurano até 2%.
- Realizar in vivo de imagens de acordo com as instruções do fabricante do sistema de imagem. Neste vídeo, o sistema será usado Lumina.
- A imagem, clique na imagem viva ícone no desktop software. Em seguida, no Painel de Controle Aquisição IVIS, selecione "Inicializar". As configurações são instrumento análogo a uma as configurações da câmera
- No Painel de Controle aquisição configurar os parâmetros do instrumento de aquisição. Para fluorescência, marque "Fluorescent". Clique na caixa de Fotografia para adquirir uma fotografia com cada imagem.
- Em seguida, defina o tempo de exposição como Auto. Em "binning Pixel CCD ou resolução", marque "Medium". Então Sob F / stop ou abertura, verifique o valor de 2. Em seguida, selecione o filtro de excitação 535 e do filtro de emissão DsRed.
- Sob campo de visão, clique em View B para a imagem de um rato.
- Em seguida, clique em adquirir para iniciar a aquisição da imagem.
- Uma vez que a aquisição da imagem está completa, use a região de interesse, ou ROI, ferramenta para medir do sinal. Clique no ícone de medição para liberar os valores do sinal e área.
- Por fim, clique em "save" para salvar a imagem na pasta de usuário
- Depois que as imagens foram salvas, interrompa a administração de isoflurano e retornar o mouse para sua gaiola. O mouse deve acordar imediatamente.
5. Resultados representante
-Usando este protocolo, O crescimento in vivo de um câncer de ovário ortotópico pode ser monitorado por pelo menos 3 semanas usando um procedimento não-invasivo.
Figura 1. MOV1 células Kat, ou PBS como controle negativo, foram ortotopicamente injetado no ovário de não-tumor ratos propensos (animal direita e esquerda e animais, respectivamente). In vivo de imagem foi realizado duas semanas mais tarde. A emissão de fluorescência gerada por células MOV1 Kat enxertada no ovário foi medida e comparada com a de rato controle negativo.
Figura 2. Seções congeladas de MOV1 tumores ovarianos Kat foram coradas com biotinilado anti-CD4 mAb seguido pelo substrato DAB (marrom escuro) para detectar tumor infiltrando linfócitos (seta preta). As células foram contracorados com metil-verde para visualizar núcleos celulares (azul). Células tumorais (setas vermelhas) foram morfologicamente distintas de células T. O slide aparece ampliado 40x.
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Discussion
Cirurgia e injeções ortotópico
Injeção ortotópico em bursa ovariana demandas de treinamento e precisão. Assim
- Em caso de pobres cirúrgica experiência prática, com cadáveres em primeiro lugar.
- Use preferencialmente mulheres multíparas (um ou dois litros) como elas se desenvolvem ovários maiores ao longo do tempo que facilita a injeção e no aumento de sobrevida para comparar com as fêmeas nulíparas.
- Devido ao pequeno tamanho da bursa ovariana mouse, o uso do menor tamanho de agulha disponível é fortemente encorajada.
In vivo de imagens
- Use sempre uma referência para fluorescência, como um tubo de 1,5 ml Ependorf preenchido com 10 junho - 10 julho MOV1 células kat em 100 ml a 1 ml de PBS.
- Alimentar os animais com alfafa dieta livre de reduzir o fundo de fluorescência.
- Cuidadosamente raspar o animal antes in vivo de imagens para reduzir fundo.
Significado
Este modelo singeneicos de câncer de ovário seroso em animais imunocompetentes que são injetados com ortotopicamente Far-vermelho células ovarianas fluorescentes câncer (MOV1 KAT) permite estudos pré-clínicos para avaliar novas estratégias para a imagem latente e terapia de tumores iniciais, quando a doença ainda é tratável, bem como monitorização in vivo de tumor respostas imunes e imunoterapias.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela subvenção NIH P01 AI 068.730 (SNC, NS), o NIH conceder CA016520 / TAPITMAT (NS), o financiamento privado da Fundação Claneil (NS), eo de ovário SPORE conceder a FCCC e da Universidade da Pensilvânia ( P50 CA83638) ea Fox Chase Cancer Center Núcleo Grant (P30 CA06927) (DCC). Os autores agradecem o apoio técnico excelente da Facilidade núcleo óptico / Bioluminescência dirigido pelo Dr. EJ Delikatny da Universidade da Pensilvânia, Anthony Secreto da Célula-Tronco e Core Xenoenxerto dirigido pelo Dr. G. Danet-Desnoyers da Universidade da Pensilvânia Cancer centro de treinamento para SNC técnica de injeção ortotópico e Dangaj Denada da Universidade de Pennsylvania / OCRC para auxiliar na cirurgia.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
Heating pad | Deltaphase | 39 DP | |
Povidone pads | Dynarex | 1108 | |
Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
3cc/insulin syringe | BD Biosciences | 309301 | |
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
Tissue adhesive | Vetbond | 3M | |
Vet Bactrim/ oral suspension | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
Isofluorane | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified | Invitrogen | 10437036 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
TurboFP635 mammalian vector | Evrogen | FP721 | |
T175 flasks | cellstar | 660-190 |
References
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L., et al. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev 22. , 255-288 (2001).
- Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
- Connolly, D. C., et al. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
- Hensley, H., et al. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
- Deliolanis, N. C., et al. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
- Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
- Shcherbo, D., et al. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
- Kiguchi, K., et al. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis 16. , 751-756 (1998).
- Bao, R., et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
- Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45. , 1-36 Forthcoming.
- Milne, K., et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. , (2009).