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Immunology and Infection

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에 종양 이미징 및 모니터링

doi: 10.3791/2146 Published: November 28, 2010

Summary

공부하기

Abstract

배경 : 난소암은 일반적으로 케이스 / 사망자 비율이 높은 고급 단계에서 진단하기 때문에 미국 여성들 사이 1,2,3 모든 gynecologic malignancies의 가장 치명적인 유적이다. 장액의 종양은 난소암의 가장 광범위한 형태이며, 4,5 TG - MISIIR 태그 유전자 변형은 저절로 종양의 유형을 개발하는 유일한 마우스 모델을 나타냅니다. Mullerian 억제 물질 유형 II 수용체 (MISIIR) 유전자 프로 모터 6 제어하에 TG - MISIIR 태그 마우스 표현 SV40 변환 영역. 추가 형질 라인은 그 표현 SV40 태그 transgene을 확인하고 있지만, 난소 종양을 개발하지 않습니다. 비 - 종양 발생하기 쉬운 쥐들이 C57Bl / 6 마​​우스에 대한 일반적인 수명을 전시하고 비옥한 있습니다. 이 생쥐는 TG - MISIIR 태그 - DR26 생쥐에서 분리된 종양 세포에 대한 syngeneic allograft받는 사람으로 사용할 수 있습니다.

목표 : 종양 이미징 7 가능하지만, 깊은 종양의 조기 발견은 작은 생활 동물에 도전합니다. 장액의 난소암에 대한 immunologically 손상 동물 모델의 잠복기 연구를 활성화하기 위해, 우리는 생체내 이미징, 종양 microenvironment 및 종양 면역 반응의 연구에 허가 난소암의 유형에 대한 syngeneic 마우스 모델을 설명합니다.

방법 : 우리는 먼저 26주 된 DR26 TG - MISIIR 태그의 여성에 수확 자연 난소 종양에서 태그 + 마우스 암 세포주 (MOV1)을 파생. 그렇다면, 우리는 안정 Katushka을 인코딩 TurboFP635 Lentivirus 포유 동물 벡터, 여기 / 635분의 588 nm의 8,9,10에서 방출 맥시멈와 말미잘 Entacmaea quadricolor에서 적색 형광 단백질의 멀리 붉은 돌연변와 MOV1 세포 transduced. 우리는 orthotopically 아닌 종양이 발생하기 쉬운 TG - MISIIR 태그 여성 생쥐의 난소 11,12,13,14에서 MOV1 언니를 심었을 거예요. 종양 진행은 생체내 광학 이미징 및 종양의 microenvironment에 immunohistochemistry에 의해 분석되었다 다음되었다.

결과 : Orthotopically MOV1 세포를 이식은 묽은 난소 종양을 개발했습니다. MOV1 종양은 인간의 난소 암 15 (그림 2)에서 관찰, 최대 주입 후 3 주 (그림 1) 생체내 이미징에 의해 시각 될 수 있으며, leukocytes로 가득 차 있었다.

결론 : 우리는 깊은 조직의 산도 안정 높이 Katushka의 photostability에 의한 초기 종양의 생체내 이미징에 적합한 난소암의 orthotopic 모델을 설명합니다. 우리는 종양 면역 반응과 immunotherapies의 생체내 이미징 연구 및 모니터링을위한 장액의 난소암이 소설 syngeneic 모델의 사용을 제안합니다.

Protocol

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1. 세포 배양

  1. orthotopic 사출, 문화 T175 플라스크에 DR26 종양에서 파생된 MOV1 세포는, 그들의 90 %까지 합류하기 전에. 1 또는 2 T175 flasks 필요합니다 주입 당 1-5000000 세포를 이용할 계획입니다.
  2. 주사 당일, 세포를 수확하고 hemocytometer를 사용하여 휴대폰 번호를 확인합니다.
  3. 일단 세포 농도는 실온에서 300 X g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠릿, 결정되었습니다.
  4. 스핀에 따라, 0.002 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 멸균 PBS 10 microliters 1 만달러에 전지를 resuspend

2. 사전 외과

  1. 이전 수술, PBS EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 microliters에서 1,000,000 MOV1 - 캣 전지와 3/10cc 인슐린 주사기를 입력합니다.
  2. 가열 패드에 isofluorane anesthetized 마우스를 전송합니다. 눈 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 추가합니다. 그런 다음, 즉시 수술 내내 마취를 제공하기 위해 isoflurane 기화기에 연결된 코 콘 시스템에 동물의 머리를 삽입합니다.
  3. 알코올 면봉으로 주입 사이트의 소독 후, subcutaneously 3/10cc 인슐린 주사기와 함께, 5 MG / 케토프로펜, 사전 수술 진통제의 kg을 주입.
  4. 가위를 사용하여 동물의 꼬리의 기본에 thoracolumbar 교차점에서 dorsum의 왼쪽 꼬리 부분을 면도. 완전히 머리를 제거하는 제모 크림을 적용합니다. 그런 다음, 젖은 종이 타월로 여분을 제거합니다.
  5. 머리가 삭제되면, povidone - 요오드와 알코올 면봉으로 면도 영역을 소독. 그런 다음, 절개의 주변 외과 드레이프를 놓으십시오.

3. 외과

  1. 그냥 수술 전에 1.5 %에 isoflurane 기화기 수준을 조정합니다.
  2. 동물이 발을 패드 곤란하여 완전히 anesthetized되었는지 확인합니다.
  3. 다음, 피부에서 비장을 찾습니다. 다음 외과 가위를 사용하면, 비장의 오른쪽 상단에있는 1~2센티미터 길이 dorsolateral 절개합니다.
  4. retroperitoneum을 해부하다. 마우스 난소를 둘러싼 패드가 관찰됩니다. 마우스 난소를 둘러싼 지방 패드를 파악하고 노출 곡선 집게를 사용하십시오.
  5. 멸균 PBS의 일부 방울과 수화물 기관.
  6. 주사에 대한 난소를 파악 철회 ... 위치를 ... 그리고 안전하게 곡선 포셉를 사용하여
  7. 단단히 포셉과 난소를 쥐고 있지만, 난소에 MOV1 종양 세포의 10 microliters을 주입. 회사 범위는 유체 병리 현상이나 누설을 방지할 수 있습니다.
  8. 즉시 주사 다음, 포셉에 의해 끼쳤다 긴장을 풀어주고있다. 난소의 천공은 저절로 취소 및 종료해야합니다.
  9. 바늘에 연결된 흡수성 Polyglycolic의 산성 봉합사를 사용하여 복고풍 - 복막 상처를 닫습니다.
  10. 코 콘에서 동물을 놓습니다.
  11. 피부를 스트레칭하고 조직 접착제의 몇 방울로 dorsolateral 상처 가장자리를 밀봉.
  12. 마지막으로, 구두로 동물에 항생제 100 microliters을 관리할 수 있습니다. 그런 다음 복구에 대한 케이지와 모니터에 다시 놓으십시오. 일주일 동안 식수의 항생제에 쓰레기야.

4. 생체내 이미징에서

  1. 일주일 MOV1 종양 세포의 orthotopic 주사 후 생체내 이미징에서 수행합니다. 이미지 실로 isofluorane anesthetized 마우스를 전송하여 시작합니다.
  2. 아래 2 % isoflurane 기화기 수준을 돌립니다.
  3. 이미징 시스템 제조 업체의 지침에 따라 생체내 이미징에서 수행합니다. 이 비디오에서 루미나 시스템이 사용됩니다.
  4. 이미지, 생활 이미지 소프트웨어 데스크톱 아이콘을 클릭하십시오. 그런 다음 IVIS 수집 제어판에서 "초기화"를 선택하십시오. 악기 설정은 카메라 설정에 유사한 아르
  5. 인수 제어판에있는 악기의 인수 매개 변수를 설정합니다. 형광 들어, "형광"을 선택하십시오. 각각의 이미지 사진을 취득 사진 상자를 클릭합니다.
  6. 다음, 자동으로 노출 시간을 설정합니다. "픽셀 비닝 또는 CCD 해상도"에서 "보통"을 확인하십시오. 그런 다음 F / 중지하거나 개구에서, 2의 가치를 확인하십시오. 다음, 535 여기 필터와 DsRed 방출 필터를 선택합니다.
  7. 보기의 분야에서, 이미지 하나의 마우스를보기 B를 클릭하십시오.
  8. 그런 다음, 이미지 수집을 시작하기 위해 취득을 클릭하십시오.
  9. 이미지 수집이 완료되면, 관심 지역, 또는 투자 수익 (ROI), 신호의 측정 도구를 사용하십시오. 신호 가치와 영역을 해제하기 위해 측정 아이콘을 클릭합니다.
  10. 마지막으로, 사용자 폴더에 이미지를 저장하려면 "저장"을 클릭하십시오
  11. 이미지가 저장되고 나면, isoflurane의 관리를 중지하고 그 새장에 마우스를 반환합니다. 마우스가 즉시 일어나해야합니다.

5. 대표 결과

- 사용이 프로토콜을, orthotopic 난소암의의 생체내 성장은 비침습 절차를 사용하여 적어도 3 주 동안 모니터링할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 대조군으로 MOV1 캣 세포, 또는 PBS는 orthotopically. 이외의 종양 발생하기 쉬운 생쥐 (각각 오른쪽과 왼쪽 동물 동물과)의 난소에 주입했다 생체내 이미징에서 2 주 후에 실시되었다. 난소에 engrafted MOV1 캣 세포에 의해 생성된 형광 방출을 측정하고 대조군 마우스에서 해당과 비교했다.

그림 2
그림 2. MOV1 난소 종양의 냉동 섹션은 mAb가 종양 침투 lymphocytes (검은색 화살표)를 감지하는 DAB 기판 (어두운 갈색) 다음 biotinylated 방지 CD4 물들일되었습니다. 세포는 세포 핵 (파란색)를 시각화하는 메틸 녹색과 counterstained되었습니다. 종양 세포는 (빨간색 화살표) T 세포에서 morphologically 뚜렷한되었습니다. 슬라이드 40x 확대 나타납니다.

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Discussion

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수술과 주사 Orthotopic

난소 부르사에서 Orthotopic 주입은 교육 및 정밀도를 요구합니다. 그러므로

  1. 첫번째 시신과 함께 가난한 수술 경험, 연습의 경우.
  2. 그들이 nulliparous 여성과 비교 주입 및 증가 생존을 용이하게 시간이 지남에 따라 더 큰 난소 개발에 우선적으로 multiparous 암컷을 (하나 또는 두 개의 새끼)를 사용합니다.
  3. 마우스 난소 부르사의 작은 크기로 인해, 가장 작은 가능한 바늘 크기의 사용은 적극 권장합니다.

생체내 이미징에

  1. 항상에 대한 참조를 사용하여 이러한 PBS의 1ml 100 μl에 10월 6일부터 10월 7일까지 MOV1 캣 세포로 가득 1.5 ML ependorf 관으로 형광.
  2. 형광 배경을 줄이기 위해 알팔파없는 다이어트로 동물 먹이.
  3. 조심스럽게 배경을 줄이기 위해 생체내 이미징에서 전에 동물을 면도.

의미

orthotopically 파 - 붉은 형광 난소암 세포 (MOV1 KAT)을 주사 면역 적격 동물 장액의 난소암이 syngeneic 모델은 질병이 아직 치료할 때 초기에 종양의 이미징 및 치료를위한 새로운 전략을 평가하는 잠복기 연구를 허용뿐만 아니라 종양 면역 반응과 immunotherapies의 생체내 모니터링처럼.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 부여 P01 AI 068,730 (SNC, NS), NIH 부여 CA016520 / TAPITMAT (NS), Claneil 재단 (NS)에서 민간 자금 및 FCCC 및 펜실베니아 대학에 난소 포자 부여 (지원했습니다 P50 CA83638)와 폭스 체이스 암 센터 코어 그랜트 (P30 CA06927) (DCC). 저자는 펜실베니아 암 대학에서 박사 G. Danet - 데스노여스 감독 줄기 세포 및 이종 이식 코어에서 펜실베니아, 안토니 Secreto 대학에서 박사 EJ Delikatny 감독 광 / Bioluminescence 핵심 시설의 우수 기술 지원을 감사합니다 수술에 도움을 위해 펜실베니아 / OCRC 대학에서 orthotopic 분사 기술과 Denada Dangaj에 훈련 SNC 센터.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-GLUTAMAX Invitrogen 10564-011
PBS GIBCO, by Life Technologies 14040
Versene Lonza Inc. 17-711E
Heating pad Deltaphase 39 DP
Povidone pads Dynarex 1108
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 17845-153
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health
3cc/insulin syringe BD Biosciences 309301
Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) Syneture 9612-31
Tissue adhesive Vetbond 3M
Vet Bactrim/ oral suspension Hi-tech Pharmacal 840823
IVIS-Lumina Caliper Life Sciences
Isofluorane Phoenix Pharmaceuticals, Inc. J108013
Fetal Bovine Serum, Qualified Invitrogen 10437036
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
TurboFP635 mammalian vector Evrogen FP721
T175 flasks cellstar 660-190

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References

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에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델<em> 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링
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Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).More

Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses. J. Vis. Exp. (45), e2146, doi:10.3791/2146 (2010).

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