Summary
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Abstract
배경 : 난소암은 일반적으로 케이스 / 사망자 비율이 높은 고급 단계에서 진단하기 때문에 미국 여성들 사이 1,2,3 모든 gynecologic malignancies의 가장 치명적인 유적이다. 장액의 종양은 난소암의 가장 광범위한 형태이며, 4,5 TG - MISIIR 태그 유전자 변형은 저절로 종양의 유형을 개발하는 유일한 마우스 모델을 나타냅니다. Mullerian 억제 물질 유형 II 수용체 (MISIIR) 유전자 프로 모터 6 제어하에 TG - MISIIR 태그 마우스 표현 SV40 변환 영역. 추가 형질 라인은 그 표현 SV40 태그 transgene을 확인하고 있지만, 난소 종양을 개발하지 않습니다. 비 - 종양 발생하기 쉬운 쥐들이 C57Bl / 6 마우스에 대한 일반적인 수명을 전시하고 비옥한 있습니다. 이 생쥐는 TG - MISIIR 태그 - DR26 생쥐에서 분리된 종양 세포에 대한 syngeneic allograft받는 사람으로 사용할 수 있습니다.
목표 : 종양 이미징 7 가능하지만, 깊은 종양의 조기 발견은 작은 생활 동물에 도전합니다. 장액의 난소암에 대한 immunologically 손상 동물 모델의 잠복기 연구를 활성화하기 위해, 우리는 생체내 이미징, 종양 microenvironment 및 종양 면역 반응의 연구에 허가 난소암의 유형에 대한 syngeneic 마우스 모델을 설명합니다.
방법 : 우리는 먼저 26주 된 DR26 TG - MISIIR 태그의 여성에 수확 자연 난소 종양에서 태그 + 마우스 암 세포주 (MOV1)을 파생. 그렇다면, 우리는 안정 Katushka을 인코딩 TurboFP635 Lentivirus 포유 동물 벡터, 여기 / 635분의 588 nm의 8,9,10에서 방출 맥시멈와 말미잘 Entacmaea quadricolor에서 적색 형광 단백질의 멀리 붉은 돌연변와 MOV1 세포 transduced. 우리는 orthotopically 아닌 종양이 발생하기 쉬운 TG - MISIIR 태그 여성 생쥐의 난소 11,12,13,14에서 MOV1 언니를 심었을 거예요. 종양 진행은 생체내 광학 이미징 및 종양의 microenvironment에 immunohistochemistry에 의해 분석되었다 다음되었다.
결과 : Orthotopically MOV1 캣 세포를 이식은 묽은 난소 종양을 개발했습니다. MOV1 캣 종양은 인간의 난소 암 15 (그림 2)에서 관찰, 최대 주입 후 3 주 (그림 1) 생체내 이미징에 의해 시각 될 수 있으며, leukocytes로 가득 차 있었다.
결론 : 우리는 깊은 조직의 산도 안정 높이 Katushka의 photostability에 의한 초기 종양의 생체내 이미징에 적합한 난소암의 orthotopic 모델을 설명합니다. 우리는 종양 면역 반응과 immunotherapies의 생체내 이미징 연구 및 모니터링을위한 장액의 난소암이 소설 syngeneic 모델의 사용을 제안합니다.
Protocol
1. 세포 배양
- orthotopic 사출, 문화 T175 플라스크에 DR26 종양에서 파생된 MOV1 캣 세포는, 그들의 90 %까지 합류하기 전에. 1 또는 2 T175 flasks 필요합니다 주입 당 1-5000000 세포를 이용할 계획입니다.
- 주사 당일, 세포를 수확하고 hemocytometer를 사용하여 휴대폰 번호를 확인합니다.
- 일단 세포 농도는 실온에서 300 X g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠릿, 결정되었습니다.
- 스핀에 따라, 0.002 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 멸균 PBS 10 microliters 1 만달러에 전지를 resuspend
2. 사전 외과
- 이전 수술, PBS EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 microliters에서 1,000,000 MOV1 - 캣 전지와 3/10cc 인슐린 주사기를 입력합니다.
- 가열 패드에 isofluorane anesthetized 마우스를 전송합니다. 눈 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 추가합니다. 그런 다음, 즉시 수술 내내 마취를 제공하기 위해 isoflurane 기화기에 연결된 코 콘 시스템에 동물의 머리를 삽입합니다.
- 알코올 면봉으로 주입 사이트의 소독 후, subcutaneously 3/10cc 인슐린 주사기와 함께, 5 MG / 케토프로펜, 사전 수술 진통제의 kg을 주입.
- 가위를 사용하여 동물의 꼬리의 기본에 thoracolumbar 교차점에서 dorsum의 왼쪽 꼬리 부분을 면도. 완전히 머리를 제거하는 제모 크림을 적용합니다. 그런 다음, 젖은 종이 타월로 여분을 제거합니다.
- 머리가 삭제되면, povidone - 요오드와 알코올 면봉으로 면도 영역을 소독. 그런 다음, 절개의 주변 외과 드레이프를 놓으십시오.
3. 외과
- 그냥 수술 전에 1.5 %에 isoflurane 기화기 수준을 조정합니다.
- 동물이 발을 패드 곤란하여 완전히 anesthetized되었는지 확인합니다.
- 다음, 피부에서 비장을 찾습니다. 다음 외과 가위를 사용하면, 비장의 오른쪽 상단에있는 1~2센티미터 길이 dorsolateral 절개합니다.
- retroperitoneum을 해부하다. 마우스 난소를 둘러싼 패드가 관찰됩니다. 마우스 난소를 둘러싼 지방 패드를 파악하고 노출 곡선 집게를 사용하십시오.
- 멸균 PBS의 일부 방울과 수화물 기관.
- 주사에 대한 난소를 파악 철회 ... 위치를 ... 그리고 안전하게 곡선 포셉를 사용하여
- 단단히 포셉과 난소를 쥐고 있지만, 난소에 MOV1 캣 종양 세포의 10 microliters을 주입. 회사 범위는 유체 병리 현상이나 누설을 방지할 수 있습니다.
- 즉시 주사 다음, 포셉에 의해 끼쳤다 긴장을 풀어주고있다. 난소의 천공은 저절로 취소 및 종료해야합니다.
- 바늘에 연결된 흡수성 Polyglycolic의 산성 봉합사를 사용하여 복고풍 - 복막 상처를 닫습니다.
- 코 콘에서 동물을 놓습니다.
- 피부를 스트레칭하고 조직 접착제의 몇 방울로 dorsolateral 상처 가장자리를 밀봉.
- 마지막으로, 구두로 동물에 항생제 100 microliters을 관리할 수 있습니다. 그런 다음 복구에 대한 케이지와 모니터에 다시 놓으십시오. 일주일 동안 식수의 항생제에 쓰레기야.
4. 생체내 이미징에서
- 일주일 MOV1 캣 종양 세포의 orthotopic 주사 후 생체내 이미징에서 수행합니다. 이미지 실로 isofluorane anesthetized 마우스를 전송하여 시작합니다.
- 아래 2 % isoflurane 기화기 수준을 돌립니다.
- 이미징 시스템 제조 업체의 지침에 따라 생체내 이미징에서 수행합니다. 이 비디오에서 루미나 시스템이 사용됩니다.
- 이미지, 생활 이미지 소프트웨어 데스크톱 아이콘을 클릭하십시오. 그런 다음 IVIS 수집 제어판에서 "초기화"를 선택하십시오. 악기 설정은 카메라 설정에 유사한 아르
- 인수 제어판에있는 악기의 인수 매개 변수를 설정합니다. 형광 들어, "형광"을 선택하십시오. 각각의 이미지 사진을 취득 사진 상자를 클릭합니다.
- 다음, 자동으로 노출 시간을 설정합니다. "픽셀 비닝 또는 CCD 해상도"에서 "보통"을 확인하십시오. 그런 다음 F / 중지하거나 개구에서, 2의 가치를 확인하십시오. 다음, 535 여기 필터와 DsRed 방출 필터를 선택합니다.
- 보기의 분야에서, 이미지 하나의 마우스를보기 B를 클릭하십시오.
- 그런 다음, 이미지 수집을 시작하기 위해 취득을 클릭하십시오.
- 이미지 수집이 완료되면, 관심 지역, 또는 투자 수익 (ROI), 신호의 측정 도구를 사용하십시오. 신호 가치와 영역을 해제하기 위해 측정 아이콘을 클릭합니다.
- 마지막으로, 사용자 폴더에 이미지를 저장하려면 "저장"을 클릭하십시오
- 이미지가 저장되고 나면, isoflurane의 관리를 중지하고 그 새장에 마우스를 반환합니다. 마우스가 즉시 일어나해야합니다.
5. 대표 결과
- 사용이 프로토콜을, orthotopic 난소암의의 생체내 성장은 비침습 절차를 사용하여 적어도 3 주 동안 모니터링할 수 있습니다.
그림 1. 대조군으로 MOV1 캣 세포, 또는 PBS는 orthotopically. 이외의 종양 발생하기 쉬운 생쥐 (각각 오른쪽과 왼쪽 동물 동물과)의 난소에 주입했다 생체내 이미징에서 2 주 후에 실시되었다. 난소에 engrafted MOV1 캣 세포에 의해 생성된 형광 방출을 측정하고 대조군 마우스에서 해당과 비교했다.
그림 2. MOV1 캣 난소 종양의 냉동 섹션은 mAb가 종양 침투 lymphocytes (검은색 화살표)를 감지하는 DAB 기판 (어두운 갈색) 다음 biotinylated 방지 CD4 물들일되었습니다. 세포는 세포 핵 (파란색)를 시각화하는 메틸 녹색과 counterstained되었습니다. 종양 세포는 (빨간색 화살표) T 세포에서 morphologically 뚜렷한되었습니다. 슬라이드 40x 확대 나타납니다.
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Discussion
수술과 주사 Orthotopic
난소 부르사에서 Orthotopic 주입은 교육 및 정밀도를 요구합니다. 그러므로
- 첫번째 시신과 함께 가난한 수술 경험, 연습의 경우.
- 그들이 nulliparous 여성과 비교 주입 및 증가 생존을 용이하게 시간이 지남에 따라 더 큰 난소 개발에 우선적으로 multiparous 암컷을 (하나 또는 두 개의 새끼)를 사용합니다.
- 마우스 난소 부르사의 작은 크기로 인해, 가장 작은 가능한 바늘 크기의 사용은 적극 권장합니다.
생체내 이미징에
- 항상에 대한 참조를 사용하여 이러한 PBS의 1ml 100 μl에 10월 6일부터 10월 7일까지 MOV1 캣 세포로 가득 1.5 ML ependorf 관으로 형광.
- 형광 배경을 줄이기 위해 알팔파없는 다이어트로 동물 먹이.
- 조심스럽게 배경을 줄이기 위해 생체내 이미징에서 전에 동물을 면도.
의미
orthotopically 파 - 붉은 형광 난소암 세포 (MOV1 KAT)을 주사 면역 적격 동물 장액의 난소암이 syngeneic 모델은 질병이 아직 치료할 때 초기에 종양의 이미징 및 치료를위한 새로운 전략을 평가하는 잠복기 연구를 허용뿐만 아니라 종양 면역 반응과 immunotherapies의 생체내 모니터링처럼.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 부여 P01 AI 068,730 (SNC, NS), NIH 부여 CA016520 / TAPITMAT (NS), Claneil 재단 (NS)에서 민간 자금 및 FCCC 및 펜실베니아 대학에 난소 포자 부여 (지원했습니다 P50 CA83638)와 폭스 체이스 암 센터 코어 그랜트 (P30 CA06927) (DCC). 저자는 펜실베니아 암 대학에서 박사 G. Danet - 데스노여스 감독 줄기 세포 및 이종 이식 코어에서 펜실베니아, 안토니 Secreto 대학에서 박사 EJ Delikatny 감독 광 / Bioluminescence 핵심 시설의 우수 기술 지원을 감사합니다 수술에 도움을 위해 펜실베니아 / OCRC 대학에서 orthotopic 분사 기술과 Denada Dangaj에 훈련 SNC 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Heating pad | Deltaphase | 39 DP | |
| Povidone pads | Dynarex | 1108 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| 3cc/insulin syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Tissue adhesive | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ oral suspension | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluorane | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| TurboFP635 mammalian vector | Evrogen | FP721 | |
| T175 flasks | cellstar | 660-190 |
References
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