Summary
Para el estudio de
Abstract
Antecedentes: El cáncer de ovario se diagnostica generalmente en una etapa avanzada, donde la proporción de casos / mortalidad es alta y por lo tanto sigue siendo el más letal de todos los cánceres ginecológicos entre los EE.UU. las mujeres 1,2,3. Los tumores serosos son las formas más generalizadas de cáncer de ovario y el 4,5 transgénicos Tg-MISIIR-TAG representa el modelo de ratón sólo que de forma espontánea se desarrolla este tipo de tumores. Tg-MISIIR-TAG ratones expresan SV40 región transformación bajo control de la sustancia inhibitoria de Müller tipo de receptor II (MISIIR) promotor del gen 6. Otras líneas transgénicas se han identificado que expresan el transgén etiqueta SV40, pero no desarrollan tumores en los ovarios. No tumorales ratones propensos exhibición típica vida de los ratones C57BL / 6 y son fértiles. Estos ratones se puede utilizar como receptores de aloinjertos singénico de células tumorales aisladas de Tg-MISIIR-Tag-DR26 ratones.
Objetivo: A pesar de imagen del tumor es posible 7, la detección temprana de los tumores profundos es un reto en animales vivos pequeños. Para permitir que los estudios preclínicos en modelos animales inmunológicamente intactos para el cáncer de ovario seroso, se describe un modelo de ratón singénico para este tipo de cáncer de ovario, que permite imágenes in vivo, los estudios del microambiente del tumor y el tumor de la respuesta inmune.
Métodos: En primer lugar, obtuvo un tag + ratón línea celular de cáncer (MOV1) de un tumor ovárico espontáneo recolectadas en un 26 semanas de edad Tg-DR26 MISIIR-Tag mujeres. Luego, de forma estable transduced MOV1 células con el vector Lentivirus TurboFP635 mamíferos que codifica Katushka, un mutante rojo lejano de la proteína fluorescente roja de la anémona de mar Entacmaea quadricolor con excitación / emisión máxima a 588/635 nm 8,9,10. Hemos implantado ortotópicamente MOV1 Kat en el ovario 11,12,13,14 de no tumorales propensos Tg-MISIIR-TAG ratones hembra. La progresión del tumor fue seguido por imágenes in vivo óptica y microambiente tumoral se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Resultados: ortotópicamente implantado células MOV1 Kat desarrollaron tumores serosos de ovario. MOV1 tumores Kat puede ser visualizado por imágenes in vivo de hasta tres semanas después de la implantación (fig. 1) y se infiltraron con los leucocitos, como se observa en el cáncer de ovario humano 15 (fig. 2).
Conclusiones: Se describe un modelo ortotópico de cáncer de ovario adecuado para imágenes in vivo de tumores antes de tiempo debido a los altos de pH estabilidad y fotoestabilidad de Katushka en los tejidos profundos. Se propone el uso de este nuevo modelo singénico de cáncer de ovario seroso en los estudios de imágenes in vivo y seguimiento de los tumores la respuesta inmune e inmunoterapias.
Protocol
1. Cultivo de células
- Antes de la inyección ortotópico, la cultura MOV1 células Kat, derivada de los tumores DR26, en un matraz T175 hasta que el 90% confluente. Plan para usar de 1 a 5 millones de células por inyección, lo que requiere de 1 o 2 frascos T175.
- En el día de la inyección, la cosecha de las células y determinar el número de células con un hemocitómetro.
- Una vez que la concentración celular se ha determinado, que sedimenten las células por centrifugación durante 5 minutos a 300 x g a temperatura ambiente.
- Después de la vuelta, volver a suspender las células tienen 1 millón en 10 microlitros de PBS estéril con EDTA 0,002 M
2. Antes de la cirugía
- Antes de la cirugía, llenar una jeringa de insulina 3/10cc con 1 millón de MOV1-Kat células en 10 microlitros de PBS con EDTA.
- La transferencia de un ratón anestesiado con isofluorano a una compresa caliente. Añadir ungüento para los ojos para evitar la deshidratación del ojo. Luego, inmediatamente inserte la cabeza del animal en un sistema de cono conectada a un vaporizador de isoflurano para entregar la anestesia durante la cirugía.
- Después de la desinfección del sitio de la inyección con alcohol, por vía subcutánea inyectar 5 mg / kg de ketoprofeno, un analgésico antes de la cirugía, con una jeringa de insulina 3/10cc.
- Usando las podadoras, afeitarse la parte izquierda de caudal en el dorso de la unión toracolumbar a la base de la cola animal. Aplicar crema de depilación para eliminar por completo el cabello. A continuación, retire el exceso con una toalla de papel húmeda.
- Una vez que el pelo se ha eliminado, esterilizar el área afeitada con povidona yodada y torundas con alcohol. Luego, coloque un paño quirúrgico en la zona de la incisión.
3. Cirugía
- Justo antes de la cirugía, ajustar los niveles de vaporizador isoflurano al 1,5%.
- Verificar que el animal está completamente anestesiado por pellizcar la almohadilla plantar.
- A continuación, busque el bazo debajo de la piel. Luego, utilizando tijeras quirúrgicas, hacer una incisión dorsolateral 1-2 cm de largo en la parte superior derecha del bazo.
- Disecar el retroperitoneo. La almohadilla alrededor del ovario de ratón se observó. Use pinzas curvas de captar y exponer la almohadilla de grasa que rodea el ovario de ratón.
- Hidratar el órgano con unas gotas de PBS estéril.
- Use pinzas curvas de entender, se retracte de la posición ... ... y luego se asegura el ovario para la inyección
- Mientras que las palancas del ovario con las pinzas, inyectar 10 microlitros de células tumorales MOV1 Kat en el ovario. Un conocimiento firme voluntad evitar la regurgitación de líquidos o fugas.
- Inmediatamente después de la inyección, la liberación de la tensión ejercida por el fórceps. La perforación en el ovario de forma espontánea debe retractarse y cerrar.
- Usando una sutura absorbible de ácido poliglicólico unido a una aguja, cerrar la herida retro-peritoneo.
- Liberar al animal del cono de la nariz.
- Estire la piel y sellar los bordes de heridas dorsolateral con unas gotas de adhesivo tisular.
- Finalmente, por vía oral administrar 100 microlitros de antibióticos a los animales. Luego se coloca de nuevo en su jaula y el monitor para la recuperación. Mantener al animal de los antibióticos en el agua de beber durante una semana.
4. Imágenes in vivo
- Una semana después de la inyección ortotópico de células tumorales MOV1 Kat, realizar imágenes in vivo. Comience por la transferencia de un ratón anestesiado con isofluorano a la cámara de imágenes.
- Baje el volumen del vaporizador isoflurano al 2%.
- Realizar imágenes in vivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante del sistema de imágenes de. En este video, el sistema de Lumina se utilizará.
- A la imagen, haga clic en la imagen viva de software icono en el escritorio. Luego, en el Panel de control IVIS adquisición, seleccione "Ejecutar". Los ajustes de los instrumentos son análogos a una configuración de la cámara
- En el Panel de Control de la adquisición de configurar los parámetros del instrumento de adquisición. De fluorescencia, marca "fluorescentes". Haga clic en la casilla de Fotografía para adquirir una fotografía con cada imagen.
- A continuación, establezca el tiempo de exposición como Auto. En "pixel binning o resolución CCD", marque "Medium". A continuación, en F / parada o apertura, comprobar el valor de 2. A continuación, seleccione el filtro de excitación de 535 y el filtro de emisiones DsRed.
- En el campo de visión, haga clic en Ver B a la imagen de un ratón.
- A continuación, haga clic en adquirir para iniciar la adquisición de la imagen.
- Una vez que la adquisición de la imagen es completa, el uso de la Región de interés o retorno de la inversión, la herramienta de medida de la señal. Haga clic en el icono de medida para liberar los valores de la señal y el área.
- Por último, haga clic en "Guardar" para guardar la imagen en la carpeta de usuario
- Después de las imágenes se han guardado, interrumpa la administración de isoflurano y devolver el ratón a su jaula. El ratón debe despertar de inmediato.
5. Resultados representante
-El uso de este protocolo, El crecimiento in vivo de un cáncer de ovario ortotópico puede ser monitoreado por lo menos 3 semanas con un procedimiento no invasivo.
Figura 1. MOV1 células Kat, o PBS como control negativo, se inyectaron ortotópicamente en el ovario de no tumorales ratones propensos (derecho de los animales y de los animales a la izquierda y, respectivamente). In vivo de imágenes se realizó después de 2 semanas. La emisión de fluorescencia generada por las células MOV1 Kat injertado en el ovario se midió y comparó con la de ratones control negativo.
Figura 2. Las secciones congeladas de tumores de ovario MOV1 Kat fueron teñidas con biotina anti-CD4 mAb de seguido de sustrato DAB (marrón oscuro) para detectar la infiltración tumoral de linfocitos (flecha negro). Las células fueron contrastados con metil-verde para visualizar los núcleos de células (azul). Las células tumorales (flechas rojas) fueron morfológicamente distinta de las células T. La diapositiva aparece magnificado 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cirugía y las inyecciones ortotópico
Inyección ortotópica en bolsa ovárica demandas de formación y precisión. Así
- En el caso de los pobres de la experiencia práctica quirúrgica, con cadáveres en primer lugar.
- Usar preferentemente mujeres multíparas (uno o dos litros) a medida que desarrollan los ovarios más grandes con el tiempo que facilita la inyección y aumentar la supervivencia de comparar con las mujeres nulíparas.
- Debido al pequeño tamaño de la bolsa de ovario de ratón, el uso de la aguja de tamaño más pequeño disponible es altamente recomendable.
Imágenes in vivo
- Utilice siempre una referencia para la fluorescencia, como por ejemplo un tubo de 1.5 ml ependorf lleno de octubre 6to-10 7 MOV1 células kat en 100 l de 1 ml de PBS.
- Alimentar a los animales con dieta libre de alfalfa para reducir la fluorescencia de fondo.
- Cuidadosamente afeitado del animal antes de imágenes in vivo para reducir el fondo.
Significado
Este modelo singénico de cáncer de ovario seroso en los animales que son inmunocompetentes ortotópicamente inyectados con rojo lejano células fluorescentes de cáncer de ovario (MOV1 KAT) permite que los estudios preclínicos para evaluar nuevas estrategias para la imagen y el tratamiento de tumores tempranos, cuando la enfermedad sigue siendo tratable, así como en la supervisión in vivo de tumores la respuesta inmune e inmunoterapias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH P01 AI 068.730 (SNC, NS), el NIH subvención CA016520 / TAPITMAT (NS), la financiación privada de la Fundación Claneil (NS), y el de ovario SPORE subvención a la CMCC y la Universidad de Pennsylvania ( P50 CA83638) y el Fox Chase Cancer Center núcleo Grant (P30 CA06927) (DCC). Los autores agradecen la excelente asistencia técnica del Fondo para el núcleo óptico / Bioluminiscencia dirigido por el Dr. EJ Delikatny en la Universidad de Pennsylvania Secreto, Antonio de la célula madre y Core Xenoinjerto dirigido por el Dr. G. Danet-Desnoyers en la Universidad de Pennsylvania cáncer Centro para el SNC de capacitación para la técnica de inyección ortotópica y Dangaj Denada en la Universidad de Pennsylvania / OCRC para ayudar en la cirugía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-GLUTAMAX | Invitrogen | 10564-011 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14040 | |
| Versene | Lonza Inc. | 17-711E | |
| Heating pad | Deltaphase | 39 DP | |
| Povidone pads | Dynarex | 1108 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 17845-153 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| 3cc/insulin syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| Polyg Polyglycolic Acid suture/needle (3/8 19mm) | Syneture | 9612-31 | |
| Tissue adhesive | Vetbond | 3M | |
| Vet Bactrim/ oral suspension | Hi-tech Pharmacal | 840823 | |
| IVIS-Lumina | Caliper Life Sciences | ||
| Isofluorane | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | J108013 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Invitrogen | 10437036 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| TurboFP635 mammalian vector | Evrogen | FP721 | |
| T175 flasks | cellstar | 660-190 |
References
- Etzioni, R., et al. The case for early detection. Nat Rev Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Sasaroli, D., Coukos, G., Scholler, N. Beyond CA125: the coming of age of ovarian cancer biomarkers. Are we there yet. Future Medicine. 3, 275-288 (2009).
- Anderson, G. L., et al. Assessing Lead Time of Selected Ovarian Cancer Biomarkers: A Nested Case Control Study. J Natl Cancer Inst. 102, 26-38 (2010).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev 22. , 255-288 (2001).
- Dubeau, L. The cell of origin of ovarian epithelial tumours. Lancet Oncol. 9, 1191-1197 (2008).
- Connolly, D. C., et al. Female mice chimeric for expression of the simian virus 40 TAg under control of the MISIIR promoter develop epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 63, 1389-1397 (2003).
- Hensley, H., et al. Magnetic resonance imaging for detection and determination of tumor volume in a genetically engineered mouse model of ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 6, (2007).
- Deliolanis, N. C., et al. Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications. J Biomed Opt. 13, (2008).
- Hoffman, R. M. A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol. 26, (2008).
- Shcherbo, D., et al. far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4, 741-746 (2007).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13, 283-286 (1993).
- Kiguchi, K., et al. A patient-like orthotopic implantation nude mouse model of highly metastatic human ovarian cancer. Clinical & experimental metastasis 16. , 751-756 (1998).
- Bao, R., et al. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J Natl Cancer Inst. 94, 522-528 (2002).
- Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In situ -Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents. Current Protocols in Pharmacology 45. , 1-36 Forthcoming.
- Milne, K., et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. , (2009).
