Summary
Мы описываем процедуру подготовки постановке
Abstract
Эмбриона дрозофилы является привлекательной моделью системы для исследования клеточных и молекулярных основ нейронных развития. Здесь мы опишем процедуру визуализации дрозофилы эмбриональной нервной системы с помощью антител к нейронов белки. Поскольку вся эмбриональных периферической нервной и центральной нервной системы хорошо характеризуется на уровне отдельных клеток (Dambly-Chaudière и др., 1986;.. Бодмер и др., 1987;. Бодмер и др., 1989), любые аберрации эти системы могут легко идентифицировать с помощью антител к различным нейронов белки. Развивающихся эмбрионов собираются в определенное время для того, чтобы эмбрионы в надлежащем стадиях развития для визуализации. После сбора, внешние слои эмбриона, мембраны хориона и конверт желточной, которая окружает эмбрион, удаляются перед фиксацией. Эмбрионы затем инкубировали с антителами нейронов и визуализировать использованием флуоресцентно меченых вторичных антител. Эмбрионы на стадии 12-17 визуализируются для доступа к эмбриональной нервной системы. На этапе 12 группы ЦНС зародыш начинает сокращение и этап 15 окончательные структуры спайка была достигнута. По стадия 17 ЦНС контрактов и ПНС полностью разработан (Кампос-Ортеги и соавт. 1985). Таким образом, изменения в структуре ПНС и ЦНС легко можно наблюдать во время этих стадиях развития.
Protocol
1. Подготовка реагентов
- Подготовка буфера PEMFA использованием 100mM Трубы, 2мм EGTA и 1 мМ MgSO 4. Отрегулируйте рН буфера до 7,0. Буфера PEMFA является фильтр стерилизуют и хранят при 4 ° C.
- Подготовка PBT, добавляя 1 мл Тритон Х-100 до 100 мл 1x PBS (фосфатно-солевым буфером) (рН 7,0). Хранить при температуре 4 ° С.
- Подготовка 5% BSA (бычий сывороточный альбумин) с 0,01% в NaAcide 1x PBS (рН 7,0).
- Подготовка солевого раствора с использованием 0,7% NaCl и 0,03% Тритон Х-100 в деионизованной воде.
- Подготовка фиксатором, объединив 4 части PEMFA буфера с 1 частью 37% формальдегида.
2. Сборник Эмбрионы
- Подготовка клетки для штамма дрозофилы интересов путем размещения> 100 летит в пластиковые бутылки, содержащей адаптер с агар пластины кормления.
- Оставьте клетку мух в темноте при комнатной температуре в течение 72 часов, меняя пластин каждые 8-12 часов, так что мухи получить приспособиться к клетке и не подносите их яйца.
- Для эксперимента собирать эмбрионы в течение 12 часов. Снимите чашку Петри из контейнера и заменить его. Возьмите удалены чашку Петри и мыть эмбрионов с использованием блюдо физиологическим раствором и чистой щеткой краску.
- Сбор эмбрионов в мелкое сито. Промыть физиологическим раствором, чтобы удалить лишнюю дрожжей.
- Использование лопаточкой аккуратно подобрать эмбрионов и поместите их в небольшой стеклянный пузырек с крышкой. Добавьте приблизительно 1 мл физиологического раствора.
3. Удаление Хорион и Желточный Мембраны и фиксации
- После сбора эмбрионов, готовят гептан-Fix решение путем объединения 50% гептана и 50% фиксатором. Решение будет слоистых гептаном на вершине и фиксатор на дне.
- В стеклянный пузырек мыть эмбрионов путем инкубации их в солевой раствор в течение 5 минут. Удалите излишки солевой помощью пипетки Пастера.
- Промыть эмбрионы деионизированной водой.
- Dechorionate эмбрионов путем инкубации их в 50% отбеливателя в течение 3 минут.
- Промыть эмбрионы тщательно деионизированной водой.
- Fix эмбрионов путем инкубации их в течение 30 минут в гептан-Fix решение с осторожном встряхивании.
- С помощью пипетки Пастера заменить фиксатором (нижний слой) с метанолом оставляя гептана в трубке. Встряхивать удалить желточной оболочки. Devitellinized эмбрионов будет опускаться на дно трубы.
- Сбор эмбрионов в новый стеклянный пузырек помощью пипетки Пастера. Промойте эмбрионы в пять раз с метанолом, каждый раз, инкубировать эмбрионов в течение 5 минут.
4. Антитела окрашивание, монтаж, и визуализация
- Увлажняет эмбрионов в смеси 50% PBT решения и 50% метанола в течение 5 минут. Затем увлажняет в 100%-ный раствор PBT в течение 5 минут.
- Блок эмбрионов путем инкубации их в 5% БСА с 0,01% NaAcide решение в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
- Эмбрионы теперь готовы на антитела окрашивания. Подготовка первичных антител путем разбавления его в соответствующей концентрации, используя 5% BSA с 0,01% NaAcide решение. Мы используем антител против белка цистеина строку (CSP), везикулярного синаптические белки и анти-HRP или пероксидазой хрена антитела, в котором признается нейронов конкретным содержанием углеводов фрагмент присутствует в поверхностных гликопротеинов и этикетки всех нейронов.
- Инкубируйте эмбрионов в течение ночи при 4 ° С в первичных решение антител.
- На следующий день, мыть эмбрионов в 10 раз с PBT в течение часа.
- Подготовка вторичного решение антител путем разбавления соответствующей концентрации. Мы используем Alexa вторичными антителами в концентрации 1:200.
- Инкубируйте эмбрионов в течение двух часов в 4 ° C на вторичном решение антител.
- Промыть эмбрионы 10 раз с PBT в течение часа.
- Инкубируйте эмбрионов на ночь в Vectashield Монтаж Средний.
- Горы эмбрионов на предметное стекло и печатью покровным стеклом с лаком для ногтей. Визуализация эмбриона использованием флуоресцентного микроскопа.
5. Представитель Результаты
СКП 
HRP-FITC 
Объединенные
Рисунок 1: представитель изображения, показывающие эмбриональных ЦНС на стадии 16-17, используя антитела против CSP (красный) и HRP (зеленый). Обратите внимание на отличие окрашивание спайки.
СКП 
HRP-FITC
"/>
Объединенные
Рисунок 2: представитель изображения, показывающие эмбриональных ПНС на стадии 16-17 с использованием антител против CSP (красный) и HRP (зеленый). Обратите внимание на повторяющиеся узоры периферических нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эмбриона дрозофилы это мощная система для исследования клеточных и молекулярных изменений во время развития нейронов. В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить целых зародышей крепление для иммуногистохимии. Мы адаптировали данный протокол от протокол, описанный в Кэрролла и Скотт, 1985. Этот протокол также может быть адаптирована для тестирования других нейронов антител, но оптимизация антител должно быть сделано. Кроме того, дефекты развития зародышевого ПНС и ЦНС могут быть легко визуализированы путем сравнения эмбрионов из разных мутантных линий. Мы успешно использовали этот протокол для визуализации ПНС и ЦНС у эмбрионов проведения мутантов двигателя белка. Под большим увеличением мы также оценивали аксонального треков в течение эмбрионального ПНС и ЦНС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
