Summary
Nous décrivons la procédure pour préparer scène
Abstract
L'embryon de drosophile est un système modèle intéressant pour étudier les bases cellulaires et moléculaires du développement neuronal. Nous décrivons ici la procédure pour la visualisation de la drosophile embryonnaire du système nerveux en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines neuronales. Depuis la toute embryonnaire nerveux périphérique et le système nerveux central sont bien caractérisés au niveau des cellules individuelles (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), les aberrations de ces systèmes peuvent être facilement identifiés à l'aide des anticorps contre différentes protéines neuronales. Les embryons en développement sont collectées à certains moments afin de s'assurer que les embryons sont au stade de développement approprié pour la visualisation. Après la collecte, les couches externes de l'embryon, la membrane chorion et l'enveloppe vitelline qui entoure l'embryon, sont enlevés avant la fixation. Les embryons sont ensuite incubés avec des anticorps neuronale et visualisés en utilisant des anticorps marqués par fluorescence secondaire. Les embryons à des stades de 12 à 17 sont visualisés pour accéder au système embryonnaire nerveux. Au stade 12 la bande de germe de SNC commence le shortening et par l'étape 15 du modèle définitif de la commissure a été atteint. Au stade 17 les contrats SNC et le SNP est entièrement développé (Campos-Ortega et al. 1985). Ainsi, les variations dans la structure de la SNP et du SNC peuvent être facilement observés au cours de ces stades de développement.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Préparer le Tampon PEMFA l'aide de canaux 100 mM, EGTA 2 mM, et 1 mM MgSO 4. Ajuster le pH du tampon à 7,0. Le tampon est PEMFA filtre stérilisé et stocké à 4 ° C.
- Préparer PBT en ajoutant 1 ml de Triton X-100 à 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Conserver à 4 ° C.
- Préparer 5% de BSA (sérum albumine bovine) avec NaAcide 0,01% dans du PBS 1X (pH 7,0).
- Préparer la solution saline à l'aide de NaCl 0,7% et 0,03% de Triton X-100 dans de l'eau déminéralisée.
- Préparer le fixatif en combinant 4 pièces tampons PEMFA avec 1 partie de formaldéhyde 37%.
2. Collecte d'embryons
- Préparer une cage pour la souche de drosophile d'intérêt en plaçant> 100 mouches dans une bouteille en plastique contenant un adaptateur d'alimentation avec plaque de gélose.
- Laisser la cage de mouches dans l'obscurité à température ambiante pendant 72 heures, en changeant les plaques toutes les 8-12 heures, de sorte que les mouches s'acclimater à la cage et ne détiennent pas leurs oeufs.
- Pour l'expérience de collecter des embryons pendant 12 heures. Retirer la boîte de Pétri à partir du conteneur et de le remplacer. Prenez la boîte de Pétri enlevé et laver les embryons hors du plat en utilisant la solution saline et un pinceau propre.
- Recueillir les embryons dans une passoire fine. Rincer avec une solution saline pour enlever tout excès de levures.
- En utilisant une spatule délicatement ramasser les embryons et les placer dans un petit flacon de verre avec un capuchon. Ajouter environ 1 ml de solution saline.
3. Retrait des membranes chorion et vitelline et de fixation
- Après la collecte des embryons, préparer la solution Heptane-Fix en combinant 50% d'heptane et fixateur de 50%. La solution sera en couches avec l'heptane sur le dessus et le fixatif sur le fond.
- Dans le flacon en verre laver les embryons en les incubant dans la solution saline pendant 5 minutes. Retirer l'excès salins aide d'une pipette Pasteur.
- Rincez les embryons avec de l'eau déminéralisée.
- Dechorionate les embryons en les incubant dans l'eau de Javel à 50% pendant 3 minutes.
- Rincez abondamment avec de l'embryon de l'eau déminéralisée.
- Fixer les embryons en les incubant pendant 30 minutes dans la solution d'heptane-Fix en agitant doucement.
- En utilisant une pipette Pasteur remplacer le fixateur (couche inférieure) avec du méthanol en laissant l'heptane dans le tube. Agiter vigoureusement pour enlever la membrane vitelline. Les embryons seront devitellinized couler au fond du tube.
- Recueillir les embryons dans un flacon en verre de nouvelles en utilisant une pipette Pasteur. Rincez les embryons cinq fois avec du méthanol, à chaque fois incuber les embryons pendant 5 minutes.
4. Coloration des anticorps, de montage et de visualisation
- Réhydrater les embryons dans un mélange de solution PBT 50% et 50% de méthanol pendant 5 minutes. Puis réhydrater en solution PBT 100% pendant 5 minutes.
- Bloquer les embryons en les incubant dans du BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01% pendant 1 heure à 4 ° C.
- Les embryons sont maintenant prêts pour la coloration des anticorps. Préparer l'anticorps primaire en le diluant à la concentration appropriée en utilisant la BSA 5% avec une solution NaAcide 0,01%. Nous utilisons un anticorps contre la protéine chaîne de cystéine (CSP), une protéine vésiculaire synaptique et un anticorps anti-HRP ou la peroxydase de raifort, qui reconnaît un neuronaux spécifiques en glucides présents dans le fragment de glycoprotéines de surface et les étiquettes tous les neurones.
- Incuber les embryons nuit à 4 ° C dans la solution d'anticorps primaire.
- Le lendemain, lavez les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure.
- Préparer la solution d'anticorps secondaire par dilution de la concentration appropriée. Nous utilisons des anticorps Alexa secondaires à une concentration de 1:200.
- Incuber les embryons pendant deux heures dans 4 ° C dans la solution d'anticorps secondaire.
- Laver les embryons 10 fois avec PBT au cours d'une heure.
- Incuber les embryons nuit dans un milieu Vectashield montage.
- Montez les embryons sur une lame de verre et de sceller la lamelle avec du vernis à ongles. Visualisez embryons en utilisant un microscope à fluorescence.
5. Les résultats représentatifs
CSP 
HRP-FITC 
Fusionnées
Figure 1: Un représentant des images montrant le SNC embryonnaire au stade 16-17, utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez la coloration distincte de la commissure.
CSP 
HRP-FITC
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Fusionnées
Figure 2: Un des images représentatives montrant le PNS embryon au stade 16 à 17 en utilisant des anticorps contre CSP (rouge) et HRP (vert). Notez les régularités répétées des neurones périphériques.
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Discussion
L'embryon de drosophile est un système puissant pour étudier les modifications cellulaires et moléculaires au cours du développement neuronal. Dans ce protocole, nous avons démontré comment préparer embryons monter ensemble pour l'immunohistochimie. Nous avons adapté ce protocole à partir du protocole décrit dans Carroll et Scott, 1985. Ce protocole peut également être adapté pour tester d'autres anticorps neuronale, mais l'optimisation des anticorps devrait être fait. De plus, des anomalies du développement embryonnaire du SNP et du SNC peuvent être facilement visualisés en comparant les embryons de différentes lignées mutantes. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour visualiser le PNS et le SNC chez les embryons porteurs de mutants de protéines motrices. Sous un fort grossissement, nous avons également évalué les pistes axonale dans le SNP embryonnaire et SNC.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
SG est soutenu par des fonds de l'Université d'État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
