Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

Summary

Vi beskriver förfarandet för att förbereda iscensatta

Abstract

Den Drosophila embryot är en attraktiv modell för att undersöka de cellulära och molekylära grunden för nervsystemets utveckling. Här beskriver vi proceduren för visualisering av Drosophila embryonala nervsystemet med hjälp av antikroppar mot neuronala proteiner. Eftersom hela embryonala perifera nervsystemet och centrala nervsystemet är väl karakteriserade i nivå med enskilda celler (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), alla avvikelser till dessa system kan lätt identifieras med hjälp av antikroppar mot olika neuronala proteiner. Utvecklingsländerna embryona samlas in vid vissa tidpunkter för att se till att embryona i rätt utvecklingsstadier för visualisering. Efter samlingen är de yttre lagren av embryot, det chorion membranet och vitelline som omger embryot, bort innan fixering. Embryon inkuberas därefter med neuronala antikroppar och visualiseras med hjälp av fluorescerande sekundära antikroppar. Embryon de led 12-17 visualiseras tillgång till embryonala nervsystemet. Vid stadium 12 i CNS grodden bandet börjar förkorta och steg 15 det slutgiltiga mönstret av commissure har uppnåtts. Genom att steg 17 i CNS kontrakt och PNS är fullt utvecklad (Campos-Ortega et al. 1985). Således kan förändringar i mönstret av PNS och CNS kan lätt observeras under dessa utvecklingsstadier.

Protocol

1. Beredning av reagenser

1. Förbered PEMFA buffert med 100mm Rör, 2mm EGTA, och 1 mm MgSO _4. Justera pH i bufferten till 7,0. Den PEMFA bufferten är filtersteriliserad och lagras vid 4 ° C.
2. Förbered PBT genom att tillsätta 1 ml Triton X-100 till 100 ml 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) (pH 7,0). Förvaras vid 4 ° C.
3. Bered 5% BSA (bovint serumalbumin) med 0,01% NaAcide i 1x PBS (pH 7,0).
4. Förbered koksaltlösning med 0,7% NaCl och 0,03% Triton X-100 i avjoniserat vatten.
5. Förbered fixativ genom att kombinera 4 delar PEMFA buffert med 1 del 37% formaldehyd.

2. Insamling av embryon

1. Förbered en bur för Drosophila stam av intresse genom att placera> 100 flugor i en plastflaska som innehåller en adapter med agar utfodring platta.
2. Lämna buren av flugor i mörker vid rumstemperatur under 72 timmar, byta plattor var 8-12 timmar, så att flugorna blir acklimatiserad till buren och inte håller sina ägg.
3. För experimentet samla embryon för 12 timmar. Ta bort petriskål från behållaren och byta ut den. Ta bort petriskål och tvätta embryona bort skålen med koksaltlösning och en ren pensel.
4. Samla embryona i en fin sil. Skölj med koksaltlösning för att avlägsna överflödigt jäst.
5. Med hjälp av en spatel försiktigt plocka upp embryona och placera dem i en liten injektionsflaska av glas med ett lock. Tillsätt ca 1 ml koksaltlösning.

3. Borttagning av Chorion och vitelline Membran och Fixering

1. Efter insamlingen av embryon, förbereda heptan-Fix-lösning genom att kombinera 50% heptan och 50% fixeringsmedel. Lösningen kommer att varvas med heptan på toppen och fixeringsmedel på botten.
2. I glasflaska tvätta embryon genom att inkubera dem i saltlösning i 5 minuter. Ta bort överflödig saltlösning med en pasteurpipett.
3. Skölj embryon med avjoniserat vatten.
4. Dechorionate embryona genom att inkubera dem i 50% blekmedel i 3 minuter.
5. Skölj embryon noggrant med avjoniserat vatten.
6. Fäst embryon genom att inkubera dem i 30 minuter i heptan-Fix lösning med försiktig skakning.
7. Med hjälp av en pasteurpipett ersätta fixativ (understa lagret) med metanol lämnar heptan i röret. Skaka kraftigt för att ta bort vitelline membranet. Den devitellinized embryon kommer att sjunka till botten av röret.
8. Samla embryona i en ny glasflaska med en pasteurpipett. Skölj embryon fem gånger med metanol, varje gång inkubera de embryon i 5 minuter.

4. Antikropp färgningen, Montering och visualisering

1. Rehydrera embryona i en blandning av 50% PBT-lösning och 50% metanol i 5 minuter. Sedan rehydrera i 100% PBT-lösning i 5 minuter.
2. Blockera embryona genom att inkubera dem i 5% BSA med 0,01% NaAcide lösning under 1 timme vid 4 ° C.
3. Embryon är nu redo för antikroppar färgning. Förbered den primära antikroppen genom att späda det till lämplig koncentration med 5% BSA med 0,01% NaAcide lösning. Vi använder oss av en antikropp mot cystein strängen protein (CSP), en vesikulär synaptiska protein och ett anti-HRP eller pepparrot peroxidas antikropp, som erkänner ett neuronal specifik kolhydratkomplex närvarande i ytglykoproteinerna och etiketter alla nervceller.
4. Inkubera embryon över natten vid 4 ° C i den primära antikroppen lösningen.
5. Följande dag, tvätta embryon 10 gånger med PBT under loppet av en timme.
6. Förbered sekundär antikropp lösning genom att späda ut lämplig koncentration. Vi använder Alexa sekundära antikroppar vid en koncentration av 1:200.
7. Inkubera embryon för två timmar i 4 ° C i den sekundära antikroppen lösningen.
8. Tvätta embryona 10 gånger med PBT under loppet av en timme.
9. Inkubera embryon natten i Vectashield monteringsmedel.
10. Montera embryon på en glasplatta och försegla locket glida med nagellack. Visualisera embryon med hjälp av en fluorescensmikroskop.

5. Representativa resultat

CSP

HRP-FITC

Sammanfogade
Figur 1: En representant bilder som visar embryonala CNS i etapp 16-17, med hjälp av antikroppar mot CSP (röd) och HRP (grön). Notera den distinkta färgning av commissure.

CSP

HRP-FITC
"/>
Sammanfogade
Figur 2: En representant bilder som visar embryonala PNS i etapp 16-17 med antikroppar mot CSP (röd) och HRP (grön). Notera upprepade mönster av perifera nervceller.

Discussion

Den Drosophila embryot är ett kraftfullt system för att utreda de cellulära och molekylära förändringar under nervsystemets utveckling. I detta protokoll har vi visat hur man förbereder hela montera embryon för immunohistokemi. Vi har anpassat detta protokoll från det protokoll som beskrivs i Carroll och Scott, 1985. Detta protokoll kan också anpassas för att testa andra neuronala antikroppar, men optimering av antikroppar bör göras. Dessutom kan utvecklingsmässiga defekter på embryonala PNS och CNS enkelt visualiseras genom att jämföra embryon från olika mutant linjer. Vi har med framgång använt detta protokoll för att visualisera PNS och CNS i Embryon som mutanter motor protein. Enligt hög förstoring har vi också utvärderat axonal spår inom embryonala PNS och CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000