Summary
我们描述了程序准备上演
Abstract
果蝇的胚胎是有吸引力的模型系统，为研究神经元发育的细胞和分子基础。在这里，我们描述了果蝇胚胎神经系统使用神经元蛋白的抗体的可视化的过程。由于整个胚胎周围神经和中枢神经系统，在单个细胞水平（Dambly - Chaudière等，1986;。博德默等，1987;。博德默等 ，1989），这些系统的像差以及特点可以很容易地确定使用不同的神经元蛋白的抗体。胚胎发育是在特定的时间收集，以确保在适当的可视化的发展阶段的胚胎。集合后，胚胎的外层，蛋壳膜和周围胚胎的卵黄信封，被删除前固定。胚胎，然后与神经细胞抗体培养和可视化使用荧光标记的抗体。在阶段的胚胎12-17可视化访问胚胎的神经系统。阶段12的中枢神经系统生殖乐队开始阶段15的缩短和明确的格局已经实现的合缝。通过阶段17中枢神经系统的合同和PNS的全面发展（坎波斯，奥尔特加等人1985年）。因此，在PNS和CNS格局的变化可以很容易地观察到在这些发育阶段。
Protocol
1。试剂的制备
- 准备PEMFA缓冲区，使用100mm的管道，2mm的EGTA，1毫米硫酸镁 4 。缓冲区的pH值调整至7.0。 PEMFA缓冲过滤消毒和储存在4 ° C
- PBT的加入为1ml准备TRITON X - 100至100ml 1X PBS（磷酸盐缓冲液）（pH值7.0）。保存在4 ° C。
- 准备1X PBS（pH值7.0）0.01％NaAcide的5％BSA（牛血清白蛋白）。
- 准备的盐溶液，用0.7％NaCl和去离子水0.03％的Triton X - 100。
- 准备结合PEMFA缓冲区4部分第1部分37％的甲醛固定液。
2。收集胚胎
- 一个笼子里，放置在一个塑料瓶含有琼脂喂养板适配器> 100 苍蝇 ，果蝇的利益应变准备。
- 保留在室温下72小时的苍蝇在黑暗的牢笼，改变板，每8-12小时，使苍蝇得到驯化笼，并且不要把鸡蛋。
- 为实验收集了12个小时的胚胎。从容器中取出培养皿中，并取代它。以取出培养皿和关闭的菜洗的胚胎，使用的盐溶液和一个干净的油漆刷。
- 收集在一个细筛的胚胎。用生理盐水漂洗，除去多余的酵母。
- 使用压舌板轻轻地拿起胚胎和它们放置在一个小玻璃瓶，一顶帽子。关于盐溶液中添加1毫升。
3。去除卵壳和卵黄膜和固定
- 随着胚胎的收集，准备庚烷50％和50％的固色剂结合的庚烷解决办法。该解决方案将与正庚烷的顶部和底部的固定液分层。
- 在玻璃小瓶，他们在5分钟的盐水洗孵化的胚胎。删除多余的盐水，用巴斯德吸管。
- 用去离子水冲洗的胚胎。
- Dechorionate胚胎孵化在50％，3分钟漂白。
- 用去离子水彻底冲洗胚胎。
- 孵育30分钟，他们在轻轻摇动庚烷解决办法修复的胚胎。
- 使用巴斯德吸管取代留在管的正庚烷甲醇固定液（底层）。摇大力消除卵黄膜。 devitellinized胚胎将沉到试管底部。
- 收集在一个新的玻璃小瓶，用巴斯德吸管的胚胎。胚胎洗净用甲醇5次，每次5分钟孵化的胚胎。
4。抗体染色，安装和可视化
- 补充水分在50％PBT解决方案和50％甲醇为5分钟的混合胚胎。然后在100％PBT溶液5分钟补充水分。
- 胚胎在5％BSA孵育0.01％，为1小时NaAcide解决方案，在4 ° C座
- 现在，胚胎抗体染色的准备。准备稀释至适当浓度0.01％的NaAcide溶液中使用5％BSA的主要抗体。我们使用一种抗体对半胱氨酸字符串蛋白（CSP），水泡突触蛋白和抗辣根过氧化物酶或辣根过氧化物酶抗体，它承认一个神经元的具体碳水化合物基团在表面的糖蛋白和标签的所有神经元。
- 4℃过夜孵育的胚胎° C的主要抗体溶液。
- 翌日，洗的胚胎与PBT的10倍，超过一个小时的过程中。
- 准备二次抗体溶液，通过稀释适当浓度。我们使用Alexa的抗体浓度为1:200。
- 孵育两小时的胚胎在4 ° C的二次抗体溶液。
- 洗净的胚胎与PBT的10倍，超过一个小时的过程中。
- 孵育过夜Vectashield安装中等的胚胎。
- 山在玻片上的胚胎，并用指甲油密封盖玻片。使用荧光显微镜可视化胚胎。
5。代表性的成果
总警司
HRP - FITC 
合并
图1：一个显示16-17阶段的胚胎的中枢神经系统，使用抗体对CSP（红色）和HRP（绿色）代表图像。请注意不同的染色的合缝。
总警司
HRP - FITC
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合并
图2：一个阶段16日至17日对CSP（红色）和HRP（绿色）抗体的胚胎PNS的代表图像。需要注意的外周神经元的重复模式。
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Discussion
果蝇胚胎是一个功能强大的系统，为在神经元发育的调查细胞和分子的变化。在这个协议中，我们已经演示了如何准备整装胚胎进行免疫组化。卡罗尔和斯科特，1985年的协议，我们已经适应了这个协议。该协议还可以适应测试其他神经元抗体，但抗体的优化应该做。此外，胚胎PNS和中枢神经系统的发育缺陷，可以很容易地通过比较不同的突变品系的胚胎可视化。我们已经成功地使用这一协议，以可视化的期票，并在账面马达蛋白突变体的胚胎的中枢神经系统。在高放大倍率下，我们也评估内的胚胎PNS和CNS轴突的轨道。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
SG是从美国纽约州立大学布法罗分校和约翰R. Oishei基金会的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
