Summary
हम मंचन तैयार करने की प्रक्रिया का वर्णन
Abstract
ड्रोसोफिला भ्रूण neuronal विकास के सेलुलर और आणविक आधार जांच के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है. यहाँ हम ड्रोसोफिला भ्रूण तंत्रिका neuronal प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग प्रणाली के दृश्य के लिए प्रक्रिया का वर्णन . चूंकि पूरे भ्रूण परिधीय तंत्रिका और केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली अच्छी तरह से व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर (; Bodmer एट अल, 1987;. Dambly - Chaudière एट अल, 1986 Bodmer एट अल, 1989) में विशेषता है, इन प्रणालियों के लिए किसी भी aberrations सकता आसानी से विभिन्न neuronal प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग पहचान की. विकासशील भ्रूण निश्चित समय पर एकत्रित कर रहे हैं करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण के दृश्य के लिए उचित विकास के चरणों में हैं. संग्रह के बाद भ्रूण की बाहरी परत, chorion झिल्ली और vitelline लिफाफा है कि भ्रूण के चारों ओर, निर्धारण से पहले हटा रहे हैं. भ्रूण तो neuronal एंटीबॉडी के साथ incubated हैं और fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए कल्पना. चरणों में भ्रूण 12-17 भ्रूण तंत्रिका तंत्र का उपयोग करने के लिए कल्पना कर रहे हैं. सीएनएस 12 अवस्था में रोगाणु बैंड छोटा शुरू होता है और 15 मंच द्वारा commissure की निश्चित पैटर्न हासिल किया गया है. 17 चरण तक सीएनएस अनुबंध और पीएन को पूरी तरह (Campos Ortega एट अल 1985) विकसित की है. इस प्रकार पीएन और CNS के पैटर्न में बदलाव को आसानी से इन विकास के चरणों के दौरान देखा जा सकता है है.
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- PEMFA बफर 100mm पाइप्स, 2mm EGTA, और 1 मिमी MgSO 4 का उपयोग कर तैयार है . बफर का पीएच 7.0 करने के लिए समायोजित करें. PEMFA बफर फिल्टर और निष्फल डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत है
- के 1ml जोड़कर पीबीटी तैयार Triton एक्स 100 से 100ml 1x पीबीएस (फास्फेट खारा buffered) (पीएच 7.0). 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- 1x पीबीएस (7.0 पीएच) में 0.01% NaAcide के साथ 5% BSA (गोजातीय सीरम albumin) तैयार करें.
- खारा समाधान 0.7% NaCl और 0.03% ट्राइटन विआयनीकृत जल में X-100 का उपयोग कर तैयार है.
- 1 हिस्सा 37% Formaldehyde के साथ 4 PEMFA बफर भागों के संयोजन के द्वारा लगानेवाला तैयार करें.
2. भ्रूण के संग्रह
- अगर खिला थाली के साथ एक adapter युक्त एक प्लास्टिक की बोतल में> 100 मक्खियों रखकर ड्रोसोफिला तनाव के लिए ब्याज की एक पिंजरे तैयार.
- कमरे के तापमान पर 72 घंटे के लिए अंधेरे में मक्खियों के पिंजरे, छोड़ दो प्लेटों के बदलते हर 8-12 घंटे, ताकि मक्खियों पिंजरे को आदत हो और उनके अंडे पकड़ नहीं है.
- के लिए 12 घंटे के लिए प्रयोग भ्रूण इकट्ठा. कंटेनर से पेट्री डिश निकालें और यह जगह. हटाया पेट्री डिश ले लो और पकवान बंद भ्रूण नमकीन घोल और एक साफ पेंट ब्रश का उपयोग कर धो लो.
- एक ठीक चलनी में भ्रूण ले लीजिए. नमक के साथ कुल्ला किसी भी अतिरिक्त खमीर हटायें.
- एक रंग का प्रयोग धीरे से ऊपर भ्रूण लेने और एक टोपी के साथ एक छोटे कांच की शीशी में उन्हें जगह. नमकीन घोल के बारे में 1ml जोड़ें.
3. Chorion और Vitelline झिल्ली के हटाने और फिक्सेशन
- भ्रूण के संग्रह के बाद, 50% हेपटैन और 50% लगानेवाला के संयोजन के द्वारा हेपटैन - फिक्स समाधान तैयार करते हैं. समाधान ऊपर और नीचे पर लगानेवाला पर हेपटैन साथ स्तरित हो जाएगा.
- कांच की शीशी में उन्हें 5 मिनट के लिए नमकीन घोल में incubating द्वारा भ्रूण धो लो. अतिरिक्त खारा एक पाश्चर विंदुक का उपयोग निकालें.
- विआयनीकृत जल के साथ भ्रूण कुल्ला.
- उन्हें 3 मिनट के लिए 50% ब्लीच में incubating द्वारा भ्रूण Dechorionate.
- भ्रूण विआयनीकृत जल के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
- 30 मिनट के लिए उन्हें कोमल झटकों के साथ हेपटैन फिक्स समाधान में incubating द्वारा भ्रूण को ठीक करें.
- एक पाश्चर पिपेट का उपयोग मेथनॉल ट्यूब में हेपटैन छोड़ने के साथ लगानेवाला (नीचे की परत) की जगह. सख्ती शेक vitelline झिल्ली को दूर. devitellinized भ्रूण ट्यूब के नीचे डूब जाएगी.
- एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक नया ग्लास शीशी में भ्रूण लीजिए. भ्रूण मेथनॉल के साथ पांच बार कुल्ला करने के लिए, हर बार 5 मिनट के लिए भ्रूण सेते हैं.
4. एंटीबॉडी धुंधला, बढ़ते, और विज़ुअलाइज़ेशन
- 50% पीबीटी समाधान और 5 मिनट के लिए 50% मेथनॉल का एक मिश्रण में भ्रूण rehydrate. फिर 5 मिनट के लिए 100% पीबीटी समाधान में rehydrate.
- 5% BSA में 0.01% 1 घंटे के लिए 4 NaAcide समाधान ° सी. के साथ उन्हें incubating द्वारा भ्रूण ब्लॉक
- भ्रूण अब कर रहे हैं एंटीबॉडी धुंधला के लिए तैयार है. यह उचित 0.01% NaAcide समाधान के साथ 5% BSA का उपयोग एकाग्रता को गिराए द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें. हम सिस्टीन स्ट्रिंग प्रोटीन (CSP), vesicular synaptic प्रोटीन और एक मूली विरोधी एचआरपी या घोड़े peroxidase एंटीबॉडी, जो एक neuronal विशिष्ट कार्बोहाइड्रेट सतह glycoproteins और लेबल सभी न्यूरॉन्स में मौजूद आधा भाग पहचानता के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करें.
- 4 में रातोंरात भ्रूण डिग्री सेल्सियस प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में. सेते
- अगले दिन, एक घंटे के दौरान भ्रूण के 10 से अधिक बार धो पीबीटी साथ.
- उपयुक्त एकाग्रता गिराए द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है. हम 1:200 के एक एकाग्रता में Alexa माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें.
- दो घंटे के लिए 4 में भ्रूण सेते डिग्री सेल्सियस माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में.
- भ्रूण पीबीटी के साथ एक घंटे के कोर्स पर 10 बार धोएं.
- Vectashield बढ़ते मध्यम में रातोंरात भ्रूण सेते हैं.
- एक गिलास स्लाइड पर भ्रूण पर्वत और नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची सील. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग भ्रूण कल्पना.
5. प्रतिनिधि परिणाम
CSP 
एचआरपी FITC 
मर्ज किए गए
चित्रा 1: एक प्रतिनिधि 16-17 मंच पर भ्रूण सीएनएस दिखा रहा है, CSP (लाल) और एचआरपी (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर छवियों. Commissure के अलग धुंधला नोट.
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एचआरपी FITC
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मर्ज किए गए
चित्रा 2: एक प्रतिनिधि 16-17 मंच पर भ्रूण पीएन CSP (लाल) और एचआरपी (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर दिखा छवियों. परिधीय न्यूरॉन्स की दोहराया पैटर्न नोट.
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Discussion
ड्रोसोफिला भ्रूण neuronal विकास के दौरान सेलुलर और आणविक परिवर्तन की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है. इस प्रोटोकॉल में हम कैसे immunohistochemistry के लिए पूरे माउंट भ्रूण तैयार करने के लिए प्रदर्शन किया है. हम कैरोल और स्कॉट, 1985 में वर्णित प्रोटोकॉल से इस प्रोटोकॉल अनुकूल है. इस प्रोटोकॉल अन्य neuronal एंटीबॉडी परीक्षण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन एंटीबॉडी के अनुकूलन किया जाना चाहिए. इसके अलावा, भ्रूण पीएन और सीएनएस के विकास दोष आसानी से विभिन्न उत्परिवर्ती लाइनों से भ्रूण की तुलना द्वारा visualized किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है पीएन और ले जाने के मोटर प्रोटीन म्यूटेंट भ्रूण में सीएनएस की कल्पना कर सकते हैं. उच्च वृद्धि के तहत हम भी भ्रूण पीएन और CNS के भीतर axonal पटरियों का मूल्यांकन.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एसजी से भैंस पर न्यूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय और जॉन आर Oishei फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
