Summary
Descriviamo la procedura per preparare in scena
Abstract
L'embrione Drosophila è un sistema modello interessante per studiare le basi cellulari e molecolari dello sviluppo neuronale. Qui si descrive la procedura per la visualizzazione del sistema nervoso embrionale Drosophila utilizzando anticorpi alle proteine neuronali. Dal momento che l'intero sistema nervoso periferico embrionale e nervoso centrale sono ben caratterizzati a livello delle singole cellule (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), eventuali aberrazioni di questi sistemi possono essere facilmente identificati utilizzando anticorpi per diverse proteine neuronali. Gli embrioni di sviluppo sono raccolti in certi orari per garantire che gli embrioni sono in fase di sviluppo per la corretta visualizzazione. Dopo la raccolta, gli strati esterni dell'embrione, la membrana corion e la busta vitellina che circonda l'embrione, vengono rimosse prima fissazione. Gli embrioni vengono poi incubate con anticorpi neuronali ed è visualizzato mediante fluorescente anticorpi secondari. Gli embrioni in fasi 12-17 sono visualizzate per accedere al sistema nervoso embrionale. Nella fase 12 il germe SNC band inizia dalla fase di accorciamento e 15, il modello definitivo della commessura è stato raggiunto. Dal palco 17 i contratti SNC e del SNP è completamente sviluppato (Campos-Ortega et al. 1985). Così i cambiamenti nel modello del SNP e del SNC possono essere facilmente osservati durante questi stadi di sviluppo.
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare il tampone PEMFA utilizzando tubi 100mm, 2mM EGTA, e 1 mM MgSO 4. Regolare il pH del tampone a 7,0. Il buffer è PEMFA filtro sterilizzato e conservato a 4 ° C.
- Preparare PBT con l'aggiunta di 1 ml di Triton X-100 a 100 ml 1x PBS (tampone fosfato) (pH 7,0). Conservare a 4 ° C.
- Preparare 5% BSA (albumina di siero bovino) con 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0).
- Preparare la soluzione salina con NaCl 0,7% e 0,03% Triton X-100 in acqua deionizzata.
- Preparare il fissativo combinando 4 parti tampone PEMFA con 1 parte di formaldeide al 37%.
2. Raccolta di embrioni
- Preparare una gabbia per il ceppo di Drosophila interesse mettendo> 100 vola in una bottiglia di plastica contenente un adattatore con piastra di agar alimentazione.
- Lascia la gabbia di mosche al buio a temperatura ambiente per 72 ore, cambiando le piastre ogni 8-12 ore, in modo che le mosche abituarsi alla gabbia e non tenere le loro uova.
- Per l'esperimento raccogliere embrioni per 12 ore. Rimuovere la capsula di Petri dal contenitore e sostituirla. Prendere la piastra Petri rimosso e lavare gli embrioni fuori il piatto usando la soluzione salina e un pennello pulito.
- Raccogliere gli embrioni in un setaccio fine. Sciacquare con soluzione fisiologica per rimuovere ogni eccesso di lievito.
- Con una spatola delicatamente raccogliere gli embrioni e metterli in un flaconcino di vetro con un coperchio. Aggiungere circa 1 ml di soluzione salina.
3. La rimozione delle membrane Chorion e vitellina e Fixation
- In seguito alla raccolta di embrioni, preparare la Eptano-Fix soluzione combinando eptano 50% e 50% fissativo. La soluzione sarà a strati con eptano in alto e il fissativo sul fondo.
- Nel flacone di vetro lavare gli embrioni in incubazione, in nella soluzione salina per 5 minuti. Rimuovere salina in eccesso con una pipetta Pasteur.
- Sciacquare gli embrioni con acqua deionizzata.
- Dechorionate gli embrioni in incubazione, in nel 50% di candeggina per 3 minuti.
- Sciacquare gli embrioni a fondo con acqua deionizzata.
- Fissare gli embrioni incubando per 30 minuti nel Eptano-Fix soluzione agitando delicatamente.
- Utilizzando una pipetta Pasteur sostituire il fissativo (strato inferiore) con metanolo lasciando il eptano nel tubo. Agitare vigorosamente per rimuovere la membrana vitellina. Gli embrioni devitellinized si depositano sul fondo della provetta.
- Raccogliere gli embrioni in un flacone di vetro nuovo con una pipetta Pasteur. Sciacquare gli embrioni cinque volte con metanolo, ogni volta incubare gli embrioni per 5 minuti.
4. Anticorpi colorazione, montaggio e visualizzazione
- Reidratare gli embrioni in una miscela di soluzione al 50% PBT e metanolo al 50% per 5 minuti. Poi reidratare in 100% di soluzione di PBT per 5 minuti.
- Blocco degli embrioni in incubazione, in in 5% di BSA con la soluzione NaAcide 0,01% per 1 ora a 4 ° C.
- Gli embrioni sono ora pronti per la colorazione degli anticorpi. Preparare l'anticorpo primario diluendo alla concentrazione adeguata utilizzando 5% di BSA con la soluzione NaAcide 0,01%. Noi usiamo un anticorpo contro la proteina stringa cisteina (CSP), una proteina vescicolare sinaptico e un anti-HRP o cavallo anticorpi perossidasi ravanello, che riconosce un neuronali specifici porzione di carboidrati presenti nel glicoproteine di superficie e le etichette tutti i neuroni.
- Incubare gli embrioni notte a 4 ° C nella soluzione di anticorpo primario.
- Il giorno seguente, lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora.
- Preparare la soluzione secondaria di anticorpi diluendo la concentrazione adeguata. Noi utilizziamo gli anticorpi Alexa secondario ad una concentrazione di 1:200.
- Incubare gli embrioni per due ore a 4 ° C nella soluzione di anticorpo secondario.
- Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora.
- Incubare gli embrioni pernottamento in Medio Vectashield montaggio.
- Montare gli embrioni su un vetrino e sigillare il coprioggetto con smalto. Visualizza embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza.
5. Rappresentante Risultati
CSP 
HRP-FITC 
Uniti
Figura 1: un rappresentante che mostra le immagini del sistema nervoso centrale in fase embrionale 16-17, utilizzando anticorpi contro CSP (rosso) e HRP (verde). Si noti la colorazione distinta della commessura.
CSP 
HRP-FITC
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Uniti
Figura 2: immagini rappresentative che mostra il PNS embrionale allo stadio 16-17 utilizzando anticorpi contro CSP (rosso) e HRP (verde). Si noti il pattern ripetuti di neuroni periferici.
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Discussion
L'embrione Drosophila è un potente sistema per indagare i cambiamenti molecolari e cellulari durante lo sviluppo neuronale. In questo protocollo abbiamo dimostrato come preparare gli embrioni montare tutto per immunoistochimica. Abbiamo adattato questo protocollo dal protocollo descritto a Carroll e Scott, 1985. Questo protocollo può essere adattato anche a test altri anticorpi neuronali, ma l'ottimizzazione degli anticorpi dovrebbe essere fatto. Inoltre, difetti di sviluppo embrionale del SNP e del SNC possono essere facilmente visualizzati confrontando embrioni provenienti da diverse linee mutanti. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per visualizzare il PNS e CNS in embrioni aventi proteine mutanti del motore. Sotto ingrandimento abbiamo anche valutato le tracce assonale all'interno del PNS embrionale e del SNC.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
