ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

Summary

我々は段階的な準備をする手順を説明

Abstract

ショウジョウバエの胚では神経発達の細胞および分子的基礎を調査するための魅力的なモデルシステムです。ここでは、ニューロンタンパク質に対する抗体を用いてショウジョウバエ胚神経系の視覚化のための手順を説明します。全体の胚性末梢神経および中枢神経系は、個々の細胞のレベル（。。; Bodmer ら、1987;。Dambly -オタワら 、1986 Bodmer ら 、1989）で特徴づけられるので、これらのシステムへの異常できます簡単に別のニューロンタンパク質に対する抗体を使用して識別される。胚は、胚が可視化するための適切な発達段階にあることを確認するために特定の時間に収集されます。収集した後、胚の外側の層、絨毛膜と胚を囲む卵黄のエンベロープは、固定前に削除されます。胚はその後、神経細胞の抗体とインキュベートし、蛍光標識二次抗体を用いて可視化されています。段階での胚は、12月17日胚の神経系へのアクセスを可視化されています。ステージ12で、中枢神経系胚帯は短縮を開始し、段階15で交連の決定的なパターンを実現しています。ステージ17によってCNS契約とPNSは、完全に（カンポス-オルテガら 1985）開発されています。したがって、PNSやCNSのパターンの変化は容易にこれらの発達段階で観察することができます。

Protocol

1。試薬の調製

1. 100mMのパイプ、2mMのEGTA、1 mMのMgSO _4を用いてPEMFAバッファを準備します。 7.0バッファーのpHを調整する。 PEMFAバッファがフィルター滅菌し、4℃で保存されています
2. トリトンX - 100〜100ミリリットルの1X PBS（リン酸緩衝生理食塩水）液（pH7.0）の1mlを添加することによりPBTを準備します。 4℃で保存します。
3. 1 × PBS（pH7.0）中0.01％NaAcideで5％BSA（ウシ血清アルブミン）を用意。
4. 0.7パーセントのNaCl及び0.03％脱イオン水のトリトンX - 100を使用して食塩水を準備します。
5. 1部37％ホルムアルデヒドで4つの部分PEMFAバッファを組み合わせることにより、固定剤を準備します。

2。胚のコレクション

1. 寒天栄養プレートとアダプタを含むプラスチック製のボトルに> 100ハエを配置することによって、関心のショウジョウバエのひずみのためにケージを準備します。
2. ハエがケージに順応さと彼らの卵を保持しないように、プレート毎に8-12時間を変更し、72時間室温で暗所でハエのケージにしておきます。
3. 実験では12時間胚を収集する。コンテナからペトリ皿を取り外し、それを交換してください。削除されたペトリ皿を取り、生理食塩水ときれいなペイントブラシを使って皿から胚を洗浄する。
4. 目の細かいふるいで胚を収集する。余分な酵母を除去するために生理食塩水ですすいでください。
5. スパチュラを使用すると、静かに胚をピックアップし、キャップ付きの小さなガラス瓶の中に置いてください。生理食塩水1mlの程度を追加。

3。絨毛膜と卵黄膜の除去および固定

1. 胚のコレクションに続いて、50％ヘプタンと50％の固定剤の組み合わせにより、ヘプタン、修正溶液を調製。ソリューションは、上部と下部の固定液にヘプタンで取り入れようとしている。
2. ガラス製バイアルに5分間塩水にそれらをインキュベートすることにより、胚を洗浄する。パスツールピペットを用いて過剰な生理食塩水を削除します。
3. 脱イオン水で胚を洗浄します。
4. 3分間、50％の漂白剤でそれらをインキュベートすることにより、胚をDechorionate。
5. 脱イオン水で十分に胚を洗浄します。
6. 穏やかに振盪しながらヘプタン修正溶液中で30分間、それらをインキュベートすることにより、胚を修正。
7. パスツールピペットを使用すると、チューブにヘプタンを残して、メタノールで固定剤（底層）を交換してください。卵黄膜を除去するために積極的に振る。 devitellinized胚は、チューブの底に沈むだろう。
8. パスツールピペットを使用して、新しいガラス製バイアルに胚を収集する。メタノールで胚を5回リンス、それぞれの時間は5分間胚をインキュベートする。

4。抗体染色、マウント、および可視化

1. 50パーセントPBT溶液を、5分間50％メタノールの混合液に胚を再水和。その後5分間に100％のPBT溶液で再水和する。
2. 4℃で1時間0.01％NaAcideのソリューション℃で5％BSAでそれらをインキュベートすることにより、胚をブロック
3. 胚は、現在抗体染色のための準備が整いました。 0.01％NaAcide液で5％BSAを使用して適切な濃度に希釈して一次抗体を準備する。我々は、システインの文字列の蛋白質（CSP）、小胞のシナプス蛋白質と表面の糖タンパク質と、ラベルのすべてのニューロンに存在する神経細胞の特定の炭水化物部分を認識する抗- HRPまたは馬ラディッシュペルオキシダーゼ抗体、に対する抗体を使用してください。
4. 一晩4胚をインキュベートします一次抗体溶液にCを。
5. 次の日、時間かけPBTで胚を10回洗浄する。
6. 適切な濃度に希釈して二次抗体溶液を準備します。我々は、1:200の濃度でアレクサ二次抗体を使用してください。
7. 4で2時間の胚をインキュベート° C二次抗体溶液インチ
8. 時間かけPBTで胚を10回洗浄する。
9. Vectashieldマウンティング培地で一晩胚をインキュベートする。
10. ガラススライド上胚をマウントし、マニキュア液でカバースリップをシール。蛍光顕微鏡を用いて胚を視覚化する。

5。代表的な結果

CSP

HRP - FITC

マージ
図1：CSP（赤）とHRP（緑）に対する抗体を使用して、ステージ16から17で胚中枢神経系を示す代表的な画像。交連の異なる染色に注意してください。

CSP

HRP - FITC
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マージ
図2：CSP（赤）とHRP（緑）に対する抗体を使用してステージ16から17で胚PNSを示す代表的な画像。末梢ニューロンの繰り返しパターンに注目してください。

Discussion

ショウジョウバエの胚では神経細胞の開発中に、細胞と分子の変化を調査するための強力なシステムです。このプロトコルでは、免疫組織化学のために全体のマウント胚を準備する方法を示している。私たちは、キャロルとスコット、1985年に記述されたプロトコルからこのプロトコルを適応している。このプロトコルはまた、他の神経細胞の抗体をテストするために適応させることができますが、抗体の最適化が行われる必要があります。さらに、胚PNSやCNSの発達障害は、別の突然変異系統から胚を比較することによって簡単に可視化することができる。私たちは正常にモータータンパク質の変異体を運ぶ胚におけるPNSとCNSを視覚化するためにこのプロトコルを使用している。高倍率下で我々はまた、胚PNSやCNS内に軸索のトラックを評価した。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000