Summary
Vi beskriver förfaranden för att dokumentera dygnsrytm rörelseaktivitet för
Abstract
De flesta livsformer uppvisar dygnsrytm i cellulära, fysiologiska och beteendemässiga fenomen som drivs av endogena dygnsrytm (≡ 24 tim) pacemakers eller klockor. Störningar i människans dygnsrytm systemet är förknippade med många sjukdomar eller störningar. Stora framsteg mot vår förståelse av mekanismerna bakom dygnsrytmen har vuxit fram ur genetisk skärmar där en lätt att mäta beteende rytm används som en avläsning av klockfunktion. Studier med Drosophila har gjort betydelsefulla bidrag till vår förståelse av de cellulära och biokemiska baser underliggande dygnsrytm. Standarden dygnsrytm beteende avläsning mätt i Drosophila är rörelseaktivitet. I allmänhet innebär det övervakningssystem särskilt utformade apparater som kan mäta rörelseapparaten rörelse Drosophila. Dessa enheter är inrymda i miljömässigt kontrollerade inkubatorer ligger i ett mörkrum och är baserade på användning av avbrott i en stråle av infrarött ljus att registrera rörelseaktivitet enskilda flugor som finns inne i små rör. Mätt under många dagar, Drosophila uppvisar dagliga cykler av aktivitet och inaktivitet, en beteendevetenskaplig rytm som styrs av djurets endogena dygnsrytm system. Det övergripande förfarandet har förenklats med tillkomsten av kommersiellt tillgängliga övervakning rörelseaktivitet enheter samt utveckling av programvara för dataanalys. Vi använder systemet från Trikinetics Inc., som är det förfarande som beskrivs här och är för närvarande den mest populära system som används över hela världen. På senare tid har samma övervakningsutrustning använts för att studera sova beteende hos Drosophila. Eftersom den dagliga vakna sömn cykler av många flugor kan mätas samtidigt och bara 1 till 2 veckor till ett värde av kontinuerliga data rörelseaktivitet räcker oftast, är detta system idealiskt för stora skärmar för att identifiera Drosophila manifesterar förändrad dygnsrytm eller sova egenskaper.
Protocol
Den övergripande utformningen av protokollet illustreras i figur 1. Installationsprogrammet för övervakning av rörelseaktivitet använda enheter inrymt i miljömässigt kontrollerade inkubatorer ligger i ett mörkrum måste monteras först. När den är klar kan systemet användas i alla efterföljande rytm rörelseaktivitet mätningar. För varje experiment måste man (i) förbereda försöksdjur, vilket kan innefatta att skapa transgena djur eller inrätta nödvändiga korsningar, (ii) utarbeta glasrör aktivitet som innehåller en näringskälla, (iii) belastning flyger in i verksamheten rör och anslut aktivitet monitorer till system för datainsamling, och (iv) registrera och analysera data med hjälp av olika programvaror beroende på vad dygnsrytm eller sova parametrar man vill undersöka. Häri, definierar vi "start" av experimentet som den tid då flyger i övervakningen enheter först utsätts för önskat ljus / mörker i miljö-inkubatorer.
1. Ställa in rörelseapparaten Activity Monitoring
- Övervakningssystemet innebär många utrustning poster såsom utrustning specialitet övervakning, miljö-inkubatorer som har kapacitet för dagaktiva ljusstyrning, dataenheter insamling, datorer och kringutrustning material som ledningar för att ansluta övervakningssystem till datainsamling enheter (Figur 2). Instruktioner för installation av Drosophila Activity Monitoring (DAM) datainsamlingssystem tillhandahålls av tillverkaren (Trikinetics Inc.).
- Att huset rörelseorganen aktivitet övervakning, välj en väl ventilerat utrymme, helst utrustad med temperaturregleringen, att vara en dedikerad mörkrum. Med alla de elektriska berörda systemen (t.ex. dator och företagskuvöser) som körs under en längre tid inom ett litet och begränsat utrymme, kan överdriven värme genereras vilket leder till en snabb ökning av rummets temperatur. Följaktligen kommer inkubatorer att belastas med extra arbetsbördan för att bibehålla temperatur och mer benägna att misslyckas i temperaturkontroll. Vi finner att även för väl ventilerade rum, för att övergången från luftkonditionering i sommarvärmen under hösten / vintern kan göra det svårt att hålla rumstemperatur. I sådana fall extra ventilation kan behöva installeras i det mörka rummet för att minska risken för överhettning. Dessutom är det bäst att stänga av inkubatorer som inte används för att minimera produktion av onödig värme.
- Täta rummet från externa ljuskällor. Entré kan tätas av med en svängdörr eller svart gardin. Vi föredrar en svängdörr, eftersom det minimerar risken för oönskat ljus kommer in i mörkrummet. Inne i mörkrummet, är det inte nödvändigt att arbeta helt i mörker som bananflugor dygnsrytm är inte känslig för infrarött ljus (och är mycket mindre känsliga för rött ljus jämfört med grön / blått ljus). I de fall där vi behöver se i mörkrummet men ändå vill bevara den totala mörker (t.ex. snabbt ta bort eller lägga till en apparat i en inkubator som är i sin mörka fas), använder vi bara en vanlig ficklampa som är täckt med en röd filter. Alternativt eller som komplement till, om din mörkrum har lysrör, täck dem med röda filterpapper eller har en fristående glödande skrivbord ljus belagda med sådant filterpapper. Det är högst osannolikt att exponera flyger i mörker till mycket korta exponeringar (några sekunder) av rött ljus kommer att påverka deras dygnsklockan. Dessutom, även om dygnsrytm systemet Drosophila är mycket känslig för synligt ljus, tror vi inte små knarrar av ljus i mörkrummet kommer att följdskador, i alla fall, är en god praxis att hålla inkubatorn dörrar som huset bildskärmarna öppnas först när nödvändigt. Dessutom kommer bara öppna upp en inkubator vid en tid som denna minimera risken för en inkubator på sin mörka fas utsätts för ljus från en inkubator på dess ljus fas.
- Köp en avbrottsfri strömförsörjning (UPS) enhet nödsituation backup som har tillräckligt med effekt kapacitet för att driva delar av verksamheten övervakningssystem vid surge, spik eller strömavbrott i byggnaden. Anslut UPS-enheten nödsituation backup till den akuta backup kretsen av byggnaden om det finns. Var medveten om att även om din utrustning är ansluten till en nödsituation uttag under ett strömavbrott kan det finnas en kort övergångsperiod som systemet växlar till reservkraft. Under denna övergångsperiod kan strömavbrott för ännu ett par sekunder att leda till datorer stänga och ljusen i inkubatorn är avstängd. Därför är det viktigt att säkerställa att de datorer som används för att samla in aktivitetsdata och systemet styr belysningen i inkubatorn är inte endast hakas i reservkraft, men också en UPS. Om systemet styr belysningen i inkubatorn inte direkt regleras av inkubatorn (i de flesta fall är det), så räcker det att koppla in inkubatorn i framNCY makten utan en UPS, som förlust av makt i några sekunder kommer inte att påverka kammarens temperatur. Observera att det i allmänhet en UPS-enhet bara kommer att hålla din utrustning igång för 5-30 min i avsaknad av makt, dess huvudsakliga syfte är att skydda mot tillfälliga strömavbrott under övergången från reguljära till reservkraft.
- Ställ in en dator, PC eller Macintosh, helt dedikerad för datainsamling och / eller för ljusstyrning av inkubatorer. Eftersom DAM-systemet vara igång hela tiden och obevakad, rekommenderas det att denna dator har minimal installerat, helst inte nätverksanslutning för att minimera risken för att krascha. Dessutom måste systemet bärbar datalagring, t.ex. zip-enhet, CD / DVD-brännare, eller USB, för att möjliggöra nedladdning av uppgifter som samlats in för senare analys.
- Manuellt arrangerar nätverket telefonlinjen prydligt runt hyllor av miljömässigt kontrollerade inkubatorer för att möjliggöra enkel att ansluta / koppla bort av aktivitet monitorer. Standard telefonlinjer, adaptrar och splitter kan köpas i kommersiella elektronikaffärer och används. Sätta upp flera telefonlinjer på ett sätt så att de kommer att konvergera till en stambanan och sträcker ut ur kuvösen för att ansluta till datorn.
- Anslut övervakningsutrustning inne i kuvöser till datorn via ett nätaggregat gränssnitt (aka Blå låda från Trikinetics Inc.), som tjänar till att driva verksamheten monitorn (Trikinetics Inc.) via telefonlinjen. Det här nätaggregatet gränssnitt fungerar också som ett gränssnitt för dataöverföring byter från telefonlinjen till USB-kabel. Extra ljus regulator i samma enhet i vilken kraftledning ur kuvösen Light System kan anslutas till, finns att möjliggöra kontroll av dygnsrytm inkubator belysning schemat via datorn.
- Mask möjliga ljuskällor från lysdioden elektronisk utrustning eller felaktigt sigill inkubator dörr med anka tejp eller svart tyg för att garantera fri-running rytmer mäts i frånvaro av oönskat ljus.
2. Beredning av försöksdjur
- Behavioral fenotyper i bananflugor, såsom dygnsrytm rhythmicity och sömn / vila aktivitet är mycket känsliga för genotypiska och åldersskillnader av försöksdjuren (Koh et al. 2006). Därför är det avgörande att bedöma dessa fenotyper med ordentlig kontroll djur som föds upp i samma miljöförhållanden och i samma ålder. Dessutom finns det sexuella dimorphism i dygnsrytm rhythmicity (Helfrich-Foster 2000). Den allmänna praxis är att använda vuxna manliga flugor som föds upp i 25 ° C och mellan 1 och 5 dagar gammal för rörelseaktivitet analyser. Man flyger i stället för kvinnliga flugor traditionellt används eftersom äggläggning aktivitet kommer att påverka sann mätning av rörelseaktivitet. På grund av sexuell dimorphism, kan ibland testmetoder för kvinnliga flugor vara informativ. Livsmedel som består av bara 5% sackaros och 2% Bacto agar kommer att hindra ägg av icke-jungfru kvinnor från att utveckla och rörelse kläckta larverna från att orsaka felaktiga aktivitet räknas. Alternativt kan jungfru kvinnliga flugor användas även om det kan finnas skillnader i aktiviteten profiler mellan parade och jungfruolja kvinnor (Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000).
- Vid granskningen av dygnsrytm och sömn / vila parametrar specifika mutant flugor av intresse, är det klokt att utparning muterade beståndet med vildtyp stam av samma genetiska bakgrund, exempelvis w1118 eller YW. Detta tar bort andra webbplats genetiska modifierare som potentiellt skulle kunna maskera dygnsrytm eller sova / vila fenotyp. Eftersom det inte finns någon överkorsning i Drosophila män, är det bättre att utföra korsas genom att korsa muterade honor med naturlig manlig. Den vildtyp stam kommer också att fungera som lämplig kontroll för experimentet. Seed både vildtyp kontroll och muterade flugor på samma gång i standard Drosophila mat cirka 10 till 14 dagar innan rörelseaktivitet rytmen experiment (se Bloomington Drosophila Stock Centrum för mat recept, http://flystocks.bio.indiana.edu /). Vid eclosion av avkomman, samla 1 till 5 dagar gammal hane flugor och ställ dem åt sidan för att användas för experiment.
- Med de många genetiska verktyg och resurser såsom överuttryck, RNAi, och vävnadsspecifika GAL4 drivrutin linjer flyga tillgängliga från olika lager runt om i världen, är det möjligt att dissekera effekterna av överuttryck eller knacka ner specifika gener i vävnader och temporal-specifika sätt (Brand och Perrimon 1993, McGuire et al 2004,.. Osterwalder et al 2001). Att undersöka dygnsrytm och sömn / vila parametrar som använder denna metod, flugor bär transgena konstruktioner med vävnadsspecifika eller droger inducerbara GAL4 föraren (t.ex. män) är korsade med flugor bär transgena konstruktioner med mål gener knutna till UAS responder (t.ex. virgin kvinnor) ca 14 dagar före starten av rörelseaktivitetexperiment. Vid eclosion av avkomman, samla 1 till 5 dagar gammal hane flugor och ställ dem åt sidan för att användas för experiment. Föräldrarnas linjer som används för korset rutinmässigt används som kontroller för experiment. Avkomma från korsningar av UAS responders och GAL4 linjer förare med vildtyp flugor med samma genetiska bakgrund är också lämpliga kontroller.
- Såsom anges i steg (2) och (3), hur lång tid som behövs för beredning av försöksdjur varierar stort beroende på arten och utformningen av experimentet. I de fall där transgena djur måste genereras, eller om korsningen system måste utföras kommer mer tid uppenbarligen behövas. Av logistiska skäl, det tar ca 14 dagar vid 25 ° C i Drosophila att utvecklas från ägg till vuxen flugor.
3. Beredning av aktivitet Rör
- Aktivitet rör företräda flyga livsmiljö under experimentet. De är tunna (ca 5 mm i diameter, anteckning Trikinetics erbjuder olika storlekar beroende på Drosophila arter som skall analyseras) 5 mm glasrör som innehåller maten ämne i ena änden och pluggas med garn eller plast plugg i andra änden. Eftersom glaset aktivitet rören kan återanvändas flera gånger, kommer vi att beskriva de förberedelser som med hjälp används / ej rengjord aktiviteten rör från tidigare experiment som utgångspunkt. Om du använder ny verksamhet rör, helt enkelt gå till steg (11).
- Det är bättre att använda aktiviteten rör som nyligen har gjorts sedan maten inuti rören har en tendens att torka upp och blir förorenat med svampar övertid, även om den förvaras vid 4 ° C. De är i allmänhet förberett några dagar till en vecka före starten av försöket. Det är därför viktigt att bedöma hur många rör som behövs för varje experiment innan man förbereder dem.
- Ta bort pluggarna (garn eller plastplugg) från använda aktiviteten rör och sätta dem i stort glas bägare. Rören ska bara fylla upp till hälften bägaren. Fyll bägaren med kranvatten och se till att dränka rören.
- Microwave bägaren fylld med glasrör tills vattnet kommer till full snabb koka att smälta vax och agar mat.
- Ta försiktighet att vattnet är varmt. Ta bort bägaren från mikrovågsugnen och rör rör med en spatel eller plast 10 ml pipett så att instängda vax att flyta upp till toppen. Upprepa sedan steg (4).
- Ta bort bägaren från mikrovågsugnen och vänta tills den svalna. Att sätta bägaren i kylrummet (om den är tillgänglig) kommer att påskynda processen.
- Eftersom vattnet kyls ner, kommer vaxet samlas på vattenytan och gradvis stelnar. Ta bara bort stelnat vax för hand. Detta bör bli av med de flesta av vax på rören.
- Överför verksamheten rören till en ny bägare med rent kranvatten och upprepa steg (4) och (5).
- Eftersom de flesta av vaxet har tagits bort i steg (7), är det inte nödvändigt att invänta vaxet stelna. Bara häll vatten ur bägare och överförs i rören i en annan ny bägare. Ta försiktighet att vattnet fortfarande är varmt.
- Upprepa steg (4) och (5) för sista gången. Häll vattnet ur bägaren och vänta på att aktiviteten rören svalna.
- Ladda dem vertikalt i 250 ml eller 500 ml glasbägare. Se till att de inte är för packad. Sterilisera dem genom att använda en autoklav med en torr cykel eller helt enkelt använda en torkugn att torka rören.
- Separat, för att laga mat för att ladda in i verksamheten rör, göra en lösning av 5% sackaros (Sigma) och 2% Bacto agar (BD) i destillerat vatten eller kranvatten. Autoklav för att sterilisera lösningen. Den autoklaveras mat kan användas omedelbart eller förvaras i 4 ° C under en längre tid. När maten stelnar, kommer man behöva mikrovågsugn och vätskeform det för att fylla rören. Oanvänd mat kan lagras och användas vid ett senare tillfälle.
- Maten bör helst vara ca 65 ° C när den används för att fylla aktivitet rör. Om det är för varmt, blir för mycket kondens samlas inuti rören. Om det inte är tillräckligt varm, kommer maten stelna innan rören jämnt fyllda. För att fylla verksamheten rör med mat, använd en 10 ml-pipetten på pipett den flytande livsmedel lösningen längs insidan av glaset bägaren, vilket gör att maten lösningen för att fylla den verksamhet röret från botten, till dess att rören är en tredjedel fylld med lösning. Snurra bägaren runt försiktigt för att se till att alla rör, speciellt de i mitten av bägaren, är jämnt fyllda med mat lösning. Vänta tills maten stelna helt, antingen vid rumstemperatur eller 4 ° C. Fortsätt till nästa steg när kondens inuti glasrör försvinna.
- För att ta bort aktiviteten rören från bägaren, tryck rören mot botten av bägaren och vrid rören på samma gång så att den stelnar mat i rör och i bottenav bägaren kommer separat. Ta rören ur bägaren, helst som en enda gäng.
- Rengör rören en efter en med hushållspapper för att avlägsna överflödig mat på utsidan av rören. Ställ rören åt sidan i en ren behållare.
- Ta en allmän värmare laboratorium block utan röret hållaren och täcka uppvärmning väl försiktigt med flera lager av starka aluminiumfolie. Lägg paraffin (vax) pellets i aluminium-fodrade uppvärmning väl smälta.
- Håll rören vid icke-livsmedel änden och doppa maten änden i smält vax. Doppa vaxade del i ett glas bägare fylld med kallt vatten för att påskynda vax stelning. Upprepa en gång. Doppa vaxade rören till vatten kommer att hindra rören fastnar i varandra.
- Rören kan användas direkt, eller lagras i en lufttät behållare vid 4 ° C för användning inom en vecka. Långvarig lagring kommer att leda till överdriven torkning av mat. Om rören lagras vid 4 ° C, se till att värma upp dem till rumstemperatur genom att lämna dem på bänk före användning.
4. Laddar flyger in aktivitet Rör och rörelseaktivitet Monitoring System
- Före lastning flyger till aktivitet rör, slå på inkubatorer som kommer att användas för att hysa aktiviteten monitorer. Justera temperaturen med hjälp av inkubatorn kontrollerar och ställer in ljus / mörker regimen använder DAM styrsystemet ljuset eller inkubatorer eget ljus styrsystem efter önskad experimentell design. Den tid som behövs för att ladda flyger till aktivitet rör bör vara tillräckligt för att temperaturen stabiliseras.
- Bedöva flyger med koldioxid.
- Använd en fin pensel för att försiktigt överföra en enda flyga in en aktivitet rör.
- Ta mitt i ett enda stycke garn som är ungefär en halv tum med fina pincett och sätter in garnet i non-food slutet av aktiviteten röret att täppa till öppningen och förhindra att flyga från att fly under försöket, samtidigt som tiden tillåter luftflöde i röret. Alternativt kan kapsyler med små hål (Trikinetics, Inc.) kan användas för att stänga öppningen.
- Se till att rören är lagda på deras sidor tills flugan vaknar, annars finns risken att flugan fastna till maten.
- Sätt in lysrören i verksamheten monitorer. Med de nyare, mer kompakt modell av Trikinetics monitorer (Trikinetics DAM2 och DAM2-7) är det nödvändigt att hålla rören på plats med gummiband för att säkerställa att den infraröda strålen passerar röret i mitten position.
- Sätt verksamheten följer i inkubatorer och koppla in dem till systemet för datainsamling via telefonledningar. Kontrollera med DAM programvarusystem insamling för att se till att alla skärmar är ansluten ordentligt och data samlas in från var och en av dem. Monitorn avger infraröd ljusstråle över mitten på varje glas aktivitet rör. Den rörelseaktivitet av flugor redovisas som binära rådata där "ett" är inspelad varje gång den infraröda strålen bryts eller en "nolla" är inspelad där den infraröda strålen inte bryts.
5. Experimentell design att registrera uppgifter för fastställande av Circadian Periodicitet och Amplitud
- Flugor är synkroniserade och fångas upp genom att exponera dem till önskad ljus / mörker (LD) och temperatur ordningen för 2-5 hela dagar. Den vanligaste ångan villkor är en ljus / mörker-cykel på 12 timmar ljus / 12 timmar mörkt (00:12 LD) vid 25 ° C. Denna allmänt accepterad standard villkor är i huvudsak baserad på tanken att Drosophila kom från afro-ekvatorn platser. När man studerar dygnsrytmen det finns en del formuleringar som man behöver bli bekant med. Relevant för detta protokoll är den tid då ljuset går på i inkubatorn definieras som zeitgeber tiden 0 (ZT0) och alla andra gånger är i förhållande till det värdet (t.ex. i ett 12:12 LD cykel, är ZT12 den tid då släcks). Under standardförhållanden 12:12 LD förhållanden, vildtyp Drosophila melanogaster uppvisar normalt två anfall av aktivitet, en centrerad kring ZT0 kallas "morgon" peak och en annan runt ZT12 kallas "kväll" peak (Figur 3A). Morgon och kväll skjutningarna styrs av den endogena klockan men det finns också "skrämma" svar som är övergående skurar av aktivitet som svar på ljus / mörker övergångar. Två dagar av indragning är det minsta och skulle kunna användas till exempel i stora skärmar som är mer tidskrävande och är inriktade på mätning av fritt rinnande perioder i konstant mörker (se nedan, steg 2). Men om du är intresserad av att studera aktivitetsmönster under ett dagligt ljus-mörker-cykel är det bättre att hålla flugorna i 4-5 dagar i LD för att erhålla mer data. Huvudsak att öka antalet flugor eller antalet LD dagar i den slutliga dataanalysen (t.ex. pool data från de senaste tvådagar med LD rörelseaktivitet) kommer att generera mer tillförlitliga dagaktiva aktivitet profiler och mätningar (t.ex. tidpunkten för morgon eller kväll topp). Dessutom varierar den dagliga fördelningen av aktivitet som funktion av dag-längd (fotoperiod) och temperatur. En viktig anledning till att ändra fotoperiod eller temperatur från standarden är om man ville studera hur daglig verksamhet mönster genomgår säsongens anpassning (t.ex. Chen et al 2007). Drosophila kan också fångas upp i det dagliga temperaturväxlingar (t.ex. Glaser och Stanewsky 2005. Sehadova et al. 2009). Temperatur cykler som varierar med endast 2-3 ° C är tillräckliga för att STIGA PÅ TÅG aktivitet rytmer.
- Free Running rörelseaktivitet rytmer mäts under konstant mörker och temperaturförhållanden efter luftporer perioden är slut (se ovan, steg 1). Inställningen för ljuset cykeln kan ändras när som helst i mörkret fas på den sista dagen i LD så att påföljande dag av experimentet är den första dagen i DD. Sju dagar av DD för datainsamling är tillräckligt för att beräkna den dygnsrytm period och amplitud (t.ex. makt eller styrka rytm) av flugor. I allmänhet är en stickprovsstorlek på minst 16 flugor som krävs för att erhålla tillförlitliga fritt driftperioder för en viss genotyp. Även om man bara är intresserade av att mäta dagaktiva aktivitet, är det fortfarande bäst att mäta flyger "free-running perioder i DD som förändringar i endogena period kan ändra den dagliga fördelningen av aktivitet i LD. Till exempel flugor med långa endogena perioder oftast uppvisar försenad kvällen toppar i LD (t.ex. se Figur 4).
- Vid slutet av försöket, samlade binära rådata med dammsystem programvaran laddas ner till en portabel datalagring enhet, t.ex. USB-nyckel.
- Den binära rådata behandlas med hjälp av DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) och summeras till 15 och 30 minuter lådor när man analyserar dygnsrytm parametrar, eller från 1 till 5 fack minut vid analys av sömn / vila parametrar. För närvarande är fem sammanhängande minuter av inaktivitet standard definition av sömn / vila i Drosophila (Hendricks et al 2000;. Ho och Sehgal 2005).
- Det finns många olika sätt att analysera data som samlats in på DAM-systemet men vi kommer bara ge dessa metoder rutinmässigt används i vårt laboratorium. Microsoft Excel används för att tilldela genotyp till olika prov grupper. FaasX programvara (M. Boudinot och F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrike) eller Insomniac (Matlab-baserat program, Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) används för att undersöka dygnsrytm ( t.ex. tid och kraft) eller sömn / vila (t.ex. andelen sömn, menar resten bout längd) parametrar respektive.
6. Representativa resultat
Vid färdigställandet av detta protokoll, kan man använda samma uppsättning data för att undersöka både dygnsrytm och sömn parametrar för försöksdjur i relation till kontrollen djuren.
Analys av dygnsrytm parametrar: Utbildning diagram illustrerar daglig rörelseaktivitet aktiviteter eller genomsnittet verksamhet flugor under flera dagar i LD eller DD förhållanden kan genereras med FaasX (figur 3) generellt uppvisar två anfall av aktivitet Drosophila melanogaster, en centrerad kring ZT0 (eller CT. ) kallas "morgon" peak och en annan runt ZT12 kallas (CT 12) "kväll" peak. Dessa två anfall av verksamheten styrs av endogena klocka, och kan även ses i fritt rinnande DD förhållanden (Figur 3B). Förändringar i valet av tidpunkt för aktivitet toppar lätt kan observeras i utbildning grafer och kan tyda på en förändring i egenskaperna hos endogena klockan. En annan egenskap som är ett tecken på riktig klocka funktion är föregripande ökad rörelseaktivitet observerats i LD-cykler som sker innan den faktiska mörkt till ljust eller ljus till mörk övergångar (Figur 3A, pilar). Detta beteende är klart observerats i vild typ flugor (Figur 3A), men saknas i arytmisk mutanter som per 0 (figur 3C) (Konopka och Benzer, PNAS, 1971). I fallet av per 0 mutanter, den observerade "morgon" och "kväll" toppar i LD är rent skrämma svar på grund av plötsliga förändringar i ljus / mörker förhållanden (dvs. "clockless" flyger inte förutse förändringar i miljön utan bara reagera på dem ). Förlust av beteendemässiga rhythmicity är mycket mer uttalad i DD och allmänt manifesteras i total förlust av morgonen eller på kvällen toppar rörelseaktivitet (dvs. slumpmässiga anfall av aktivitet och inaktivitet), sett i procent 0 flugor (Figur 3D). Förutom utbildning grafer kan rörelseaktivitet data representeras som dubbel-plot actogram (FaasX), där två dagar av data ritas sekventiellt på varje rad, men den sista dagen profil börjar nästa rad i två dagar med aktivitet (Figur 4). Till exempel är LD1 och 2 plottas på den första raden av than actogram. Nästa rad börjar med en upprepning av Lysdiod LD2 och följs av LD3 och så vidare. Efter detta format, är rörelseaktivitet uppgifter som spänner över hela försöket illustreras i actogram. Actograms kan ritas för varje enskild flyga, eller för varje flyga genotyp. En fördel med actograms över utbildningen grafer är att en förändring under perioden längden på daglig verksamhet rytmer är lätt att observera (Figur 4). Förutom att generera utbildning grafer och actograms kan rörelseaktivitet data från DD tillstånd lämnas till FaasX att beräkna perioden längd med ett antal olika program, bland annat cykel-P.
Analys av sömn / vila parametrar: Genom att använda den nuvarande definitionen av sömn / vila i Drosophila (Hendricks et al 2000.), Som är fem sammanhängande minuter av inaktivitet, kan man analysera data som spelats in från rörelseaktivitet analyser och undersöka flera sömn parametrar med hjälp av Insomniac (L. Ashmore), ett Matlab-baserat program. Andelen tid som flugor spenderar sova kan beräknas vid olika tidpunkter, t.ex. procent sömn varje timme (figur 5a), eller 12 timmar (Figur 5B). Andra mer vanliga sömn parametrar som kan granskas finns betyda vila bout längd (Figur 5C) och vakna aktivitet räkna (Figur 5D). Genomsnittlig sömn / vila bout längd är ett mått på hur konsoliderat sömnen och kan illustrera sömnkvaliteten. Vakna aktivitet, som namnet antyder, är ett mått på aktivitetsnivån när flugorna är vaken. Denna parameter hjälper till att skilja mellan flugor som verkligen är drabbade i sömn / vila beteenden kontra de som är antingen sjuka eller hyperaktiva. Till exempel kan flugor som helt enkelt sjuka verkar sova mer, eftersom de inte är lika rörliga. För dessa flugor, kommer deras vakna verksamheten vara lägre i förhållande till kontrollgruppen djur.
Figur 1: Flödesschema som beskriver de viktigaste stegen för testmetoder rörelseaktivitet rytmer i Drosophila De förfaranden som presenteras på vänster medan värdefulla kommentarer finns till höger.. Den tid som krävs för att utföra nödvändiga kors och genetiska manipulationer för att få flugor med rätt genotyp för specifika experiment varierar beroende på arten och utformningen av experimentet. De två stegen markerade med asterisk (*) ger tidsram för när vuxna flugor behöver seedas / parat att generera avkommor i lämplig ålder (1 till 5 dagar gamla) för experimentet.
Figur 2: Kopplingsschema illustrerar sambanden mellan de olika komponenterna för Drosophila rörelseaktivitet datainsamling med hjälp av dammsystem En särskild dator används för att registrera räknas rörelseaktivitet av Drosophila.. Aktivitet bildskärmar är inrymt inom kuvöser utrustade med temperatur och belysning (On / Off) kontroll. Datorn kan också användas för att styra tidpunkten för ljus på / av under inkubatorer om kraftkälla belysning systemet kan anslutas till nätaggregatet (tillval). Kommunikationen mellan datorn och övervakar aktiviteten / inkubatorer förvaltas av Strömförsörjning interface enheten. Datorn, strömförsörjningsenhet och inkubatorer (om belysningen är oberoende av datorn) är anslutna till vägguttaget via UPC att säkerställa en oavbruten övervakning av verksamheten och kontinuerlig belysning under den ljusa fasen. Det rekommenderas att ansluta alla elektriska apparater till kretsar akut backup i anläggningen, om det finns.
Figur 3:. Utbildning grafer genereras med hjälp FaasX visar dygnsrytm rörelseaktivitet av rytmiska vild typ flugor (W per 0 flugor som bär en per + transgen) (A och B) jämfört med arytmier W per 0 mutanter (C och D) Man flyger hölls vid 25 ° C och fångas upp i 4 dagar 12:12 LD (light: mörk) cykler följt av sju dagar i DD (konstant mörker). För varje lina var rörelseaktivitet nivåer av enskilda flugor (n> 32) mäts i 15-minuters papperskorgar och därefter i genomsnitt att få en representativ grupp profil för den linjen. A och C visar aktiviteten data som genereras från genomsnittet av de andra och tredje dagen i ljus / mörker-cykel (LD 2-3), medan B och D visar aktiviteten data som genereras från genomsnittet av de andra och tredje dagen i konstant mörker (DD 2-3 ). Vertikala streck representerar aktiviteten (i godtyckliga enheter) registreras i 15-minuters fack under den ljusa perioden (ljusgrå) eller den mörka perioden (mörkgrå). Horisontella staplar längst ner på LD utbildning grafer, vit, ljus på, svart, ljus av. ZT0 och ZT12 representerar början och slutet av fotoperiod respektive. För DD utbildning grafer, CT0 och CT12 reprESENT början och slutet av den subjektiva dagen i konstant mörker, betecknas med det grå fältet. I panel A, M = morgonrusningen, E = kväll toppen. Pilarna i panel A representerar förebyggande beteende morgon och kväll toppar observeras i vild typ flugor som är frånvarande i W per 0 arytmisk flugor.
Figur 4:. Dubbelklicka tomt actogram skapas med hjälp av FaasX programvaran illustrerar rörelseaktivitet uppgifter av flugor med vildtyp, kort eller lång tid Man flyger hölls vid 25 ° C och fångas upp i 4 dagar 12:12 LD cykler följt av åtta dagar i konstant mörker (DD) för beräkning av de fritt rinnande period (t) med hjälp av cykel-P i FaasX. Tre flyga med wild-typ perioden [W per 0, per +, per 0 mutant bär per + transgenen], lång period [W per 0, per (S47A), per 0 mutant bär per (S47A) transgenen] och kort [w per 0, per (S47D), per 0 mutant bär per (S47D) transgenen] visas här (Chiu et al 2008.). X-axeln visar ZT eller CT tid i LD eller DD respektive, och Y-axeln visar aktivitet räknas (godtyckliga enheter) summeras till 15-minuters papperskorgar. Den röda streckade linjerna ansluter kvällen toppar för varje dag av experimenten. Observera att under LD kvällen toppen är "tvingas" att hålla synkroni med 24-tim LD cykeln, medan det i DD den fria körs period kan avvika från 24 tim. Till exempel för flugor med korta perioder tidpunkten för kvällsaktivitet kommer att ske tidigare på varje följande dag i DD (när de plottas mot en 24 tim tidsskala, som visas här), medan en övergång till höger observerats för flugor med långa perioder.
. Figur 5: Beräkna sova parametrar i Drosophila Flugor (Kanton-S, CS) exponerades för vanliga 12:12 LD cykel vid 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) användes för att bearbeta data och Microsoft Excel användes för att generera diagram som visas här. Minst 70 flugor slogs samman för att få gruppens medelvärden och felstaplar (standardfel medelvärdet) visas. (A) Baseline sova beräknas varje timme, som visas är en representant daglig cykel. (B) Baseline sömn representativa dagliga cykeln beräknas varje 12 timmar. (C) Den genomsnittliga längden på varje vila match beräknas i 12-timmars intervaller. (D) Rate of vakna verksamheten beräknas varje 12 timmar.
Discussion
I detta protokoll beskrivs vi rutiner för mätning av Drosophila rytmer rörelseaktivitet, en pålitlig beteende effekt på fluga dygnsklockan som används som standard avläsning av klockfunktion. Denna analys har använts i stor skala skärmar för nya klocka mutanter (t.ex. Konopka och Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) och är ständigt används för att dissekera och förstå klockan funktion in vivo. Det har också använts för att studera cykel sova vaknar i flugor, även om senaste rapporterna tyder på att videon digitala analysen är mycket mer tillförlitlig kvantifiering av sömn än med hjälp av rytmer rörelseaktivitet (Zimmerman et al. 2008). Vid användning av rörelseaktivitet rytmer att analysera sova, andel av sömn på dagtid tenderar att överskattas.
För att säkerställa framgång och reproducerbarhet i detta protokoll är det viktigt att analysen flugor som har liknande ålder, genetisk bakgrund, och föds upp på samma villkor som beteendemässiga fenotyper i bananflugor, såsom dygnsrytm rhythmicity och sömn / vila aktivitet är mycket känsliga till alla dessa faktorer. När flera inkubatorer för ett enda experiment, är det viktigt att se till att alla inkubatorer är på den förväntade temperaturen eftersom vissa dygnsrytm parametrar kan ändras som en funktion av temperaturen. Ett varningens ord när man köper inkubatorer för att arbeta med flugor, inte alla är skapade lika. Även om vi tveka att rekommendera någon särskild enhet finns det många alternativ. En bra resurs för att hitta företag som säljer inkubatorer för Drosophila arbete ges på <www.flybase.org>. Vissa företag säljer även "Drosophila dygnsrytm" inkubatorer, där ytterligare funktioner finns tillgängliga, såsom redan inkopplat för att Trikinetics systemet och temperaturen ramp (t.ex. Tritech). Viktiga funktioner inkluderar möjligheten för dagaktiva ljusstyrning och bra temperaturkontroll i fysiologiska olika Drosophila (~ 15-30 ° C). Priser och storlekar av inkubatorer varierar mycket men med de nyare aktivitet monitorer från Trikinetics kan även små kuvöser rymma ett stort antal av dessa enheter. Dessutom, även om inkubatorer med fuktstyrning kan användas, är denna extra funktion inte nödvändigt så länge du placerar en liten kastrull med vatten för att ge fuktighet (50-70% är bra). Slutligen, även om vi rutinmässigt använder FaasX och Insomniac dataanalys i detta protokoll, det finns alternativa program och mjukvaror tillgängliga (Rosato och Kyriacou 2006), t.ex. ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Rhythm Paket (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ) och MAZ (Zordan et al. 2007).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag NIH34958 till I. E och NS061952 till JC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
- Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
- Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
- Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
- Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
- Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).
