Summary
We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes van
Abstract
De meeste vormen van leven vertonen de dagelijkse ritmes in cellulaire, fysiologische en gedragsmatige verschijnselen die worden aangedreven door endogene circadiane (≡ 24 uur), een pacemaker of klokken. Storingen in het menselijke circadiane systeem worden geassocieerd met tal van ziektes of aandoeningen. Veel vooruitgang in de richting ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan circadiaanse ritmes is ontstaan uit genetische screens waarbij een gemakkelijk te meten gedrag ritme wordt gebruikt als een read-out van klokfunctie. Studies met behulp van Drosophila hebben baanbrekende bijdragen aan ons begrip van de cellulaire en biochemische grondslagen van circadiane ritmes. De standaard circadiane gedrag uitlezing gemeten in Drosophila is locomotorische activiteit. In het algemeen, de monitoring systeem omvat speciaal ontworpen apparaten die het bewegingsapparaat beweging van Drosophila kunnen meten. Deze apparaten zijn ondergebracht in ecologisch gecontroleerde incubators gevestigd in een donkere kamer en zijn gebaseerd op het gebruik van de onderbreking van een bundel van infrarood licht om de locomotorische activiteit van individuele vliegen die in kleine buisjes vast te leggen. Gemeten gedurende vele dagen, Drosophila vertonen dagelijkse cycli van activiteit en inactiviteit, een gedrags-ritme dat wordt beheerst door endogene van het dier circadiane systeem. De algemene procedure is vereenvoudigd met de komst van commercieel verkrijgbare bewegingsactiviteit controle-apparaten en de ontwikkeling van software programma's voor data-analyse. We maken gebruik van het systeem van Trikinetics Inc, dat is de procedure hier beschreven en is momenteel de meest populaire systeem wereldwijd gebruikt. Meer recent hebben dezelfde controle-apparaten gebruikt om te slapen gedrag in Drosophila bestuderen. Omdat de dagelijkse wake-slaap cycli van veel vliegen kunnen gelijktijdig worden gemeten en slechts 1 tot 2 weken ter waarde van continue bewegingsactiviteit data is meestal voldoende, dit systeem is ideaal voor grootschalige schermen te identificeren Drosophila manifesteren veranderd circadiane of slapen eigenschappen.
Protocol
Het totale ontwerp van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1. De setup voor de bewaking locomotorische activiteit met behulp van apparatuur ondergebracht in milieuvriendelijke gecontroleerde incubators gevestigd in een donkere kamer moet eerst worden gemonteerd. Als dat eenmaal is voltooid, kan het systeem worden gebruikt in alle latere locomotorische activiteit ritme metingen. Voor elk experiment moet men (i) het opstellen proefdieren, die kunnen ook het genereren van transgene dieren of het opzetten van noodzakelijke kruisen, (ii) voor te bereiden glazen activiteit buisjes met een bron van voedsel, (iii) laden vliegt tot activiteit buizen en sluit activiteit monitoren aan het systeem van gegevensverzameling, en (iv) te registreren en analyseren van de gegevens met behulp van verschillende software, afhankelijk van wat circadiane of slapen parameters die men wil onderzoeken. Hierin bepalen we de "start" van het experiment als het moment waarop vliegt bij de controle op apparaten eerst worden blootgesteld aan het gewenste licht / donker-omstandigheden in het milieu incubators.
1. Het opzetten van het bewegingsapparaat Activity Monitoring System
- De monitoring systeem omvat een groot aantal apparaten items, zoals speciale controle-apparaten, milieu-incubators dat de capaciteit voor het overdag licht controle te hebben, het verzamelen van gegevens apparaten, computers en randapparatuur materialen, zoals bedrading naar de controle-apparaten om de gegevens te verzamelen van apparaten (figuur 2) aan te sluiten. Instructies voor de installatie van de Drosophila Activity Monitoring (DAM) het verzamelen van gegevens-systeem worden geleverd door de fabrikant (Trikinetics Inc.)
- Naar het huis van de locomotorische activiteit monitoring systeem, kies dan een goed geventileerde ruimte, bij voorkeur uitgerust met een temperatuur controle systeem, met een speciale donkere kamer te zijn. Met alle betrokken elektrische systemen (bv. computer en starterscentra) lopen voor een langere tijd in een kleine en beperkte ruimte, kan overmatige hitte worden gegenereerd wat leidt tot een snelle stijging van de temperatuur van de kamer. Bijgevolg zal incubators worden opgezadeld met extra werk om de temperatuur en meer kans om te falen in de temperatuur onder controle te houden. Vinden we dat zelfs voor goed geventileerde ruimten, de overgang van air-conditioning in de zomer om warmte in de herfst / winter kan het moeilijk maken om op kamertemperatuur te houden. In zulke gevallen extra ventilatie zou moeten worden geïnstalleerd in de donkere kamer om het risico van oververhitting te beperken. Ook is het best uit te schakelen incubators die niet in gebruik zijn om de productie van onnodig warmteverlies te minimaliseren.
- Dicht de kamer van externe lichtbronnen. Ingang kan worden afgesloten met een draaideur of een zwart gordijn. Wij geven de voorkeur een draaideur, omdat dit minimaliseert de kans op ongewenst licht in de donkere kamer. Binnen in de donkere kamer, is het niet nodig om volledig te werken in het donker als de fruitvliegjes circadiaan systeem is niet gevoelig is voor infrarood licht (en is veel minder gevoelig voor rood licht in vergelijking met groen / blauw licht). In gevallen waar we moeten zien in de donkere kamer, maar toch wil de totale duisternis (bijv. snel verwijderen of toevoegen van een controle-apparaat in een incubator die in de donkere fase) te behouden, hebben we gewoon gebruik maken van een standaard zaklamp die bedekt is met een rode filter. Als alternatief of in aanvulling op, als je donkere kamer tl-verlichting heeft, bedek ze met rode filter papier of een stand-alone gloeilamp bureaulamp bedekt met deze filter papier. Het is hoogst onwaarschijnlijk dat de blootstelling van vliegen in het donker tot zeer kortstondige blootstelling (enkele seconden) van rood licht zal hun circadiaan klok beïnvloeden. Ook, hoewel het circadiaan systeem van Drosophila is erg gevoelig voor zichtbaar licht, denken we niet klein kraakt van het licht in de donkere kamer zal gevolgschade worden, in elk geval een goede gewoonte is om de couveuse deuren die het huis van de monitoren alleen geopend wanneer nodig. Ook zal slechts openen een incubator op een tijd als deze het minimaliseren van de mogelijkheid van een couveuse op haar donkere fase wordt blootgesteld aan licht van een couveuse op haar lichte fase.
- Aankoop van een Uninterrupted Power Supply (UPS) nood-backup unit dat genoeg wattage capaciteit om de macht van de componenten van het activity monitoring systeem in geval van een surge, piek, of stroomstoring in het gebouw heeft. Sluit de UPS nood-backup unit naar de eerste hulp back-up circuit van het gebouw, indien beschikbaar. Wees ervan bewust dat, zelfs als uw apparatuur is aangesloten op een stopcontact noodsituatie tijdens een stroomstoring kan er een korte overgangsperiode worden als het systeem schakelt over op noodstroom. Tijdens die overgang, kan verlies van vermogen, zelfs voor een paar seconden voorsprong om computers af te sluiten en de lichten in de incubator is uitgeschakeld. Zo is het belangrijk ervoor te zorgen dat de computers worden gebruikt om de activiteit van gegevens en het systeem bedienen van verlichting in de incubator zijn niet alleen verslaafd in noodstroomvoorzieningen, maar ook een UPS te verzamelen. Als het systeem de controle verlichting in de incubator is niet direct geregeld door de incubator (in de meeste gevallen is), dan is het voldoende om de couveuse stekker in het emergeNCY macht zonder een UPS, het verlies van macht voor een paar seconden heeft geen invloed op de kamer temperatuur. Merk op dat in het algemeen een UPS-apparaat alleen uw apparatuur gedurende 5-30 min te houden in het ontbreken van vermogen, haar belangrijkste doel is om te beschermen tegen tijdelijk verlies van de macht tijdens de overgang van regelmatig tot de noodstroomvoorziening.
- Stel een computer, PC of Macintosh, volledig bestemd voor het verzamelen van gegevens en / of voor licht controle van de incubators. Aangezien het DAM-systeem zal worden uitgevoerd de hele tijd en zonder toezicht, is het aanbevolen dat deze computer een minimale software geïnstalleerd, bij voorkeur geen netwerkverbinding om het risico van crashen te minimaliseren. Daarnaast moet het systeem draagbare dataopslag, zoals ZIP drive, CD / DVD-brander, USB, toe te staan voor het downloaden van gegevens verzameld voor verdere analyse.
- Handmatig netjes regelen van de telefoonlijn netwerk rond de rekken van de milieuvriendelijke gecontroleerde incubators voor het gemak van het aansluiten / loskoppelen van activiteit monitoren mogelijk te maken. Standaard telefoonlijnen, adapters, splitters en kan worden gekocht in de commerciële elektronische winkels en gebruikt. U meerdere telefoonlijnen op een manier zodanig dat ze samen in een hoofdleiding en uit te breiden buiten de couveuse aan te sluiten op de computer.
- Sluit de controle op apparaten in de incubators op de computer via een voeding-interface-eenheid (alias Blue box van Trikinetics Inc), die dient om de macht van de Activity Monitor (Trikinetics Inc) via de telefoonlijn. Deze voeding interface-eenheid fungeert ook als een interface voor data-overdracht omschakelen van telefoonlijn naar USB-kabel. Optioneel licht controller in dezelfde eenheid waarin de macht snoer van de incubator licht systeem kan worden aangesloten, is beschikbaar voor de controle van circadiane incubator verlichting schema laat via de computer.
- Masker mogelijke lichtbronnen van LED van elektronisch apparaat of verkeerd seal incubator deur met ducktape of zwarte doek om free-running ritmes zorgen voor zijn gemeten in de afwezigheid van ongewenst licht.
2. De voorbereiding van proefdieren
- Behavioral fenotypes in fruitvliegen, zoals circadiane ritmiek en slaap / rust-activiteit zijn zeer gevoelig voor genotypische en leeftijd verschillen van de proefdieren (Koh et al.. 2006). Daarom is het cruciaal om deze fenotypen met behulp van een goede controle dieren die zijn gefokt in dezelfde milieu-voorwaarden en van dezelfde leeftijd te beoordelen. Daarnaast is er seksueel dimorfisme in circadiane ritmiek (Helfrich-Foster 2000). De algemene praktijk is het gebruik van volwassen mannelijke vliegen die worden gefokt in 25 ° C en tussen 1 tot 5 dagen oud voor locomotorische activiteit assays. Man vliegt in plaats van vrouwtjes worden van oudsher gebruikt omdat leg activiteit waar het meten van motorische activiteit beïnvloeden. Als gevolg van seksueel dimorfisme, kan soms het testen van vrouwtjes informatief zijn. Voedsel dat bestaat uit alleen maar 5% sucrose en 2% Bacto agar wordt voorkomen dat eieren van niet-maagdelijke vrouwen uit ontwikkelingslanden en de beweging van uitgekomen larven van het veroorzaken van foutieve activiteit telt. Als alternatief kan maagdelijke vrouwtjes worden gebruikt, hoewel er misschien verschillen in activiteit tussen de profielen gekoppeld en maagdelijke vrouwen (Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000).
- Bij de behandeling van circadiane en slaap / rest parameters van specifieke mutant vliegen van belang zijn, is het verstandig om de mutant voorraad outcross met het wild-type stam van dezelfde genetische achtergrond, bijvoorbeeld w1118 of yw. Dit verwijdert tweede site genetische modifiers die mogelijk zou kunnen maskeren circadiane of slaap / rust fenotype. Omdat er geen crossing-over in Drosophila mannen, is het beter om de outcross uit te voeren door het kruisen van mutant vrouwen met een wild-type mannetjes. De wild-type stam zal ook dienen als de juiste controle voor het experiment. Zaad zowel het wild-type-controle en mutant vliegt op hetzelfde moment in de standaard Drosophila voedsel ongeveer 10 tot 14 dagen voor de locomotorische activiteit ritme experiment (zie Bloomington Drosophila Stock Center for food recept; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Bij Eclosion van de nakomelingen, het verzamelen van 1 tot 5 dagen oude mannelijke vliegt en leg ze opzij om te worden gebruikt voor de experimenten.
- Met de vele genetische instrumenten en middelen, zoals overexpressie, RNAi, en weefsel-specifieke GAL4 driver vliegen lijnen beschikbaar uit verschillende voorraad centra wereldwijd, is het mogelijk om de effecten van overexpressie of kloppen-down specifieke genen ontleden in weefsel-en temporele-specifieke manier (Brand en Perrimon 1993; McGuire et al. 2004;.. Osterwalder et al. 2001). Om te onderzoeken circadiane en slaap / rust parameters met behulp van deze aanpak, vliegt die transgene constructen met weefsel-specifieke of drugs-induceerbare GAL4 driver (bijv. mannen) worden gekruist om te vliegen die transgene constructen met doelwitgenen aan de UAS responder (bijv. maagdelijke vrouwen) ongeveer 14 dagen voor de aanvang van de bewegingsactiviteitexperimenten. Bij Eclosion van de nakomelingen, het verzamelen van 1 tot 5 dagen oude mannelijke vliegt en leg ze opzij om te worden gebruikt voor de experimenten. De ouderlijke lijnen gebruikt worden voor het kruis worden routinematig gebruikt als controle voor de experimenten. Nakomelingen van kruisingen van UAS responder en GAL4 chauffeur lijnen met wild type vliegen van de dezelfde genetische achtergrond zijn ook passende controles.
- Zoals aangegeven in stappen (2) en (3), de lengte van de tijd die nodig is voor de voorbereiding van proefdieren is sterk afhankelijk van de aard en de opzet van het experiment. In het geval dat transgene dieren moeten worden gegenereerd of u wilt oversteken schema's moeten worden uitgevoerd, meer tijd zal uiteraard nodig zijn. Om logistieke redenen, duurt het ongeveer 14 dagen bij 25 ° C gedurende Drosophila te ontwikkelen van eieren tot volwassen vliegen.
3. De voorbereiding van de activiteit Tubes
- Activiteit buizen staan voor de fly leefgebied tijdens het experiment. Ze zijn dun (ongeveer 5 mm in diameter, noot, Trikinetics biedt verschillende groottes, afhankelijk van de Drosophila soorten worden getest) 5 mm glazen buisjes dat voedsel stof bevatten, aan de ene kant en aangesloten met draad of plastic stekker aan het andere uiteinde. Sinds glazen activiteit buizen kunnen worden hergebruikt meerdere keren, beschrijven we de voorbereiding procedures door gebruik te maken gebruikt / ongereinigde activiteit van buizen uit eerdere experimenten als uitgangspunt. Als u gebruik maakt van nieuwe activiteit buizen, gewoon doorgaan naar stap (11).
- Het is beter om niet toe te passen buizen die vers worden gemaakt, omdat het voedsel in de buizen heeft de neiging op te drogen en wordt besmet met schimmels overuren, zelfs indien bewaard bij 4 ° C. Ze zijn over het algemeen bereid een paar dagen tot een week voor de start van het experiment. Het is daarom belangrijk om het aantal buizen die nodig is voor elk experiment te beoordelen voor de voorbereiding van hen.
- Verwijder de stekkers (garen of plastic stekker) uit gebruikte activiteit tubes en zet ze in grote glazen beker. De buizen moeten alleen vullen de helft van de beker. Vul het bekerglas met kraanwater, en zorg ervoor dat de buizen onder water.
- Magnetron van de beker gevuld met glazen buizen tot het water komt tot volledige snel koken te smelten van de was en agar voedsel.
- Wees voorzichtig dat het water warm is. Verwijder het bekerglas van de magnetron en roer de buizen met een spatel of plastic 10 ml pipet om opgesloten wax te zweven naar de top. Herhaal vervolgens stap (4).
- Verwijder het bekerglas van de magnetron en wacht tot hij is afgekoeld. Zetten de beker in de koude kamer (als deze beschikbaar is) zal het proces versnellen.
- Als het water afkoelt, zal de was verzamelen over de oppervlakte van het water en geleidelijk stolt. Verwijder de gestolde was met de hand. Dit moet ontdoen van de meeste van de was op de buizen.
- Overdracht van de activiteit buizen aan een nieuwe beker met vers leidingwater en herhaal de stappen (4) en (5).
- Aangezien de meeste van de was is verwijderd in stap (7), is het niet nodig te wachten tot de was is gestold. Giet het water uit de beker en de overdracht van de buizen in een nieuwe beker. Wees voorzichtig dat het water nog warm is.
- Herhaal de stappen (4) en (5) voor de laatste keer. Giet het water uit de beker en wacht tot de activiteit buizen om af te koelen.
- Verticaal laden ze in 250 ml of 500 ml glazen bekers. Zorg ervoor dat ze niet te stevig aangedrukt. Steriliseer ze met behulp van een autoclaaf met een droge cyclus of gewoon gebruik maken van een droogoven om de buizen te drogen.
- Afzonderlijk, om voedsel te bereiden op te laden in de activiteit tubes, maak een oplossing van 5% sacharose (Sigma) en 2% Bacto agar (BD) in gedestilleerd water of leidingwater. Autoclaaf om de oplossing te steriliseren. De geautoclaveerd voedsel kan onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen in 4 ° C gedurende een langere tijd. Zodra het voedsel stolt, zal men moeten magnetron en vloeibaar in om de buizen te vullen. Ongebruikte deel van voedsel kan worden opgeslagen en gebruikt op een later tijdstip.
- Het voedsel moet idealiter rond de 65 ° C bij gebruik voor het vullen van activiteit buizen. Als het te warm, te veel condens ophopen in de buizen. Als het niet warm genoeg is, zal het voedsel stollen voordat de buizen gelijkmatig gevuld. Voor het vullen van de activiteit buizen met voedsel, gebruik dan een 10 mL pipet, om het vloeibare voedsel oplossing pipet langs de binnenwand van het bekerglas, zodat het voedsel oplossing om de activiteit buis vullen van de bodem, totdat de buizen zijn een derde gevuld met de oplossing. Schud de beker rond voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle buizen, in het bijzonder degenen die in het midden van de beker, worden gelijkmatig gevuld met voedsel oplossing. Wacht tot het voedsel volledig of stollen op kamertemperatuur of 4 ° C. Ga door naar de volgende stap na condensatie in de glazen buizen verdrijven.
- Voor het verwijderen van de activiteit buizen uit de beker, druk op de buizen naar de onderkant van de beker en draai de buizen op hetzelfde moment, zodat de gestolde voedsel in de buizen en de bodemvan de beker zal scheiden. Haal de buizen uit de beker, bij voorkeur als een bos.
- Reinig de buizen een voor een met keukenpapier om het overtollige voedsel te verwijderen aan de buitenkant van de buizen. Zet de tubes in een schone container.
- Neem een algemene laboratorium blok verwarming, zonder de buis houder en bedek de verwarming goed voorzichtig met meerdere lagen van sterk aluminium folie. Voeg paraffine (wax) pellets in de aluminium omzoomde verwarming goed te smelten.
- Houd de buizen op de non-food te beëindigen en dip het voedsel uiteinde in de gesmolten was. Dompel de gewaxte gedeelte in een glazen beker gevuld met koud water te versnellen wax stollen. Herhaal een keer. Dompelen van de gewaxte buizen in het water wordt voorkomen dat de buizen aan elkaar plakken.
- De buizen kunnen direct worden gebruikt, of opgeslagen in een luchtdichte container bij 4 ° C voor gebruik binnen een week. Langdurige opslag zal leiden tot uitdroging van het voedsel. Als de buizen worden opgeslagen bij 4 ° C, zorg ervoor om ze op te warmen tot omgevingstemperatuur door ze op de bank boven voorafgaand aan gebruik.
4. Het laden Vliegen in Activiteit Buizen en Locomotorische Activity Monitoring System
- Voorafgaand aan het laden vliegt tot werkzaamheid buizen, schakelt u de incubators die zullen worden gebruikt om de activiteit monitoren huis. Pas de temperatuur met de incubator controles en zet de licht / donker-regime met de DAM-systeem licht-controller of de incubators eigen licht controle systeem volgens de gewenste experimentele opzet. De tijd die nodig is om vliegen te laden in activiteit buizen moeten voldoende zijn om de temperatuur te stabiliseren.
- Verdoven de vliegen met kooldioxide.
- Gebruik een fijn penseel om voorzichtig de overdracht van een enkel vliegen in een activiteit buis.
- Pak het midden van een stuk garen dat is rond half een centimeter met fijne tang en steek de draad in de non-food einde van de activiteit buis om de opening plug en de vlieg kan ontsnappen tijdens het experiment, terwijl op hetzelfde tijd waardoor de luchtstroom in de buis. Als alternatief kan kunststof doppen met kleine gaatjes (Trikinetics, Inc) worden gebruikt om de opening te sluiten.
- Zorg ervoor dat de buizen worden gelegd op hun kant totdat de vlieg ontwaakt, anders bestaat het gevaar van de vlieg vast komen te zitten aan het eten.
- Plaats de buizen in de activiteit monitoren. Met de nieuwere, meer compact model van de Trikinetics monitoren (Trikinetics DAM2 en DAM2-7), is het noodzakelijk om de buizen te houden in plaats met elastiekjes om ervoor te zorgen dat de infraroodstraal de buis in het midden positie passeert.
- Doe de activiteit monitoren in de incubators en haak ze tot het systeem van gegevensverzameling via de telefoon draden. Controleer het gebruik van de DAM-systeem collectie software om ervoor te zorgen dat alle monitoren zijn aangesloten goed en gegevens worden verzameld van elk van hen. De monitor straalt infrarode lichtstraal in het midden van elke activiteit glazen buis. De locomotorische activiteit van de vliegen worden opgenomen als onbewerkte binaire gegevens waar "een" is opgenomen elke keer dat de infrarode straal wordt onderbroken of een 'nul' is opgenomen, waarin de infrarode straal niet gebroken is.
5. Experimental Design het vastleggen van data voor de bepaling van het circadiaans Periodiciteit en Amplitude
- Vliegen zijn gesynchroniseerd en meegevoerd door hen blootstellen aan het gewenste licht / donker (LD) en temperatuur regeling voor 2-5 volle dagen. De meest gebruikte entrainment voorwaarde is een licht / donker cyclus van 12 uur licht / 12 uur donker (12:12 LD) bij 25 ° C. Deze algemeen aanvaarde standaard voorwaarde is voornamelijk gebaseerd op de gedachte dat Drosophila is ontstaan uit Afro-equatoriale locaties. Bij het bestuderen van circadiaanse ritmes is er enige fraseologie die men nodig heeft om vertrouwd te raken met. Relevant voor dit protocol, de tijd als de lichten gaan op in de incubator is gedefinieerd als zeitgeber tijd 0 (ZT0) en alle andere tijden zijn ten opzichte van die waarde (bijvoorbeeld in een 12:12 LD-cyclus, ZT12 is het moment waarop de lichten worden uitgeschakeld). Onder standaard condities 12:12 LD, wild type Drosophila melanogaster doorgaans vertonen twee periodes van activiteit, een rond ZT0 aangeduid als "'s morgens" piek en een rond ZT12 aangeduid als "avond" piek (Figuur 3A). De ochtend en 's avonds periodes worden gecontroleerd door de endogene klok, maar er zijn ook "prikkeling" antwoorden die zijn van voorbijgaande aard uitbarstingen van activiteit in reactie op de licht / donker overgangen. Twee dagen van entrainment is het minimum en kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld in grote schermen die meer tijd in beslag en zijn gericht op het meten van free-running periodes in constante duisternis (zie hieronder, stap 2). Echter, als je geïnteresseerd bent in het bestuderen van de activiteit patronen tijdens een dagelijkse licht-donker cyclus, is het beter om de vliegen te behouden voor 4-5 dagen in LD om zo te verkrijgen meer gegevens. Wezen, waardoor het aantal vliegen of het aantal LD dag in de uiteindelijke data-analyse (bijv. zwembad gegevens van de laatste tweedag waarde van LD bewegingsactiviteit) zal meer betrouwbare dagelijkse activiteit profielen en metingen (bijvoorbeeld, timing van de ochtend-of avondspits). Bovendien is de dagelijkse verdeling van de activiteit varieert in functie van de daglengte (fotoperiode) en temperatuur. Een belangrijke reden voor het veranderen van de fotoperiode of de temperatuur van de standaard is als een wilde om te bestuderen hoe de dagelijkse activiteitenpatronen seizoensgebonden aanpassing (bv. Chen et al., 2007.) Ondergaan Drosophila kan ook worden meegevoerd naar de dagelijkse temperatuur cycli (bv. Glaser en Stanewsky 2005.; Sehadova et al.. 2009). Temperatuur cycli die variëren van slechts 2-3 ° C voldoende zijn om meevoeren activiteit ritmes.
- Free running locomotorische activiteit ritmes worden gemeten onder constante donkere en temperatuur omstandigheden na de entraining periode klaar is (zie boven, stap 1). De instelling voor het licht cyclus kan elk moment worden gewijzigd in het donker fase op de laatste dag van LD zodanig dat de daaropvolgende dag van het experiment de eerste dag van DD vertegenwoordigt. Zeven dagen van DD het verzamelen van gegevens is voldoende om de circadiane periode en amplitude (bijv. kracht of sterkte van het ritme) van vliegen te berekenen. In het algemeen is een steekproef van ten minste 16 vliegt nodig is om een betrouwbare free-running periodes voor een bepaald genotype te verkrijgen. Zelfs als men is alleen geïnteresseerd in het meten van dagelijkse activiteit, is het nog steeds het beste om de vliegen 'free-running perioden in DD maatregel als veranderingen in het endogene periode kan de dagelijkse verdeling van de activiteit in LD veranderen. Bijvoorbeeld, vliegt met lange endogene periodes meestal vertraagd 's avonds pieken vertonen in LD (zie bijvoorbeeld figuur 4).
- Aan het einde van het experiment, ruwe binaire data verzameld met behulp van de DAM-systeem software wordt gedownload op een draagbare data opslag apparaat, zoals USB-stick.
- De ruwe binaire data wordt verwerkt met behulp van DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc) en opgeteld in de 15 en 30 minuten bakken bij het analyseren van circadiane parameters, of van 1 tot 5 minuten bakken bij de analyse van de slaap / rust parameters. Op dit moment, vijf aaneengesloten minuten van inactiviteit is de standaard definitie van slaap / rust in Drosophila (Hendricks et al., 2000;. Ho en Sehgal 2005).
- Er zijn veel verschillende manieren om de gegevens die zijn verzameld op de DAM-systeem te analyseren, maar we zullen alleen die methoden routinematig gebruikt in ons lab. Microsoft Excel wordt gebruikt om genotype toewijzen aan verschillende sample groepen. FaasX software (M. Boudinot en F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrijk) of Insomniac (Matlab-programma, Leslie Ashmore, de Universiteit van Pittsburgh, PA) worden gebruikt om na te gaan circadiane ( bijvoorbeeld periode en stroom) of slaap / rust (bijvoorbeeld het percentage slapen, bedoel rest bout lengte) parameters respectievelijk.
6. Representatieve resultaten
Na de voltooiing van dit protocol, kan men gebruik maken van dezelfde gegevens ingesteld op zowel de circadiane en slapen parameters van de proefdieren in relatie tot de controle-dieren te onderzoeken.
Analyse van de circadiane parameters: Onderwijs grafieken illustreren de dagelijkse motorische activiteiten of activiteiten van de gemiddelde vliegt over enkele dagen in LD of DD voorwaarden kan worden gegenereerd met behulp van FaasX (figuur 3) Drosophila melanogaster vertonen in het algemeen twee periodes van activiteit, een gecentreerd rond ZT0 (of CT. ) aangeduid als "'s morgens" piek en een ander rond ZT12 (CT 12) aangeduid als "avond" piek. Deze twee periodes van de activiteiten worden gecontroleerd door de endogene klok, en kan zelfs worden waargenomen in de vrije-running DD omstandigheden (Figuur 3B). Veranderingen in de timing van deze activiteit pieken kunnen gemakkelijk worden waargenomen in het onderwijs grafieken en kan een verandering in de eigenschappen van de endogene klok aan te geven. Een andere eigenschap die indicatief is voor een goede klok functie is de anticiperende toename van de locomotorische activiteit waargenomen in LD cycli die optreedt voorafgaand aan de feitelijke donker naar licht of licht naar donker overgangen (figuur 3A, pijlen). Dit gedrag is duidelijk waargenomen in wild-type vliegt (Figuur 3A), maar is afwezig in arrhythmic mutanten, zoals per 0 (Figuur 3C) (Konopka en Benzer, PNAS, 1971). In het geval van de per 0 mutanten, de waargenomen "morgen" en "avond" pieken in LD zijn louter schrikreacties als gevolg van abrupte veranderingen in licht / donkere omstandigheden ('klokloze' ie vliegt niet anticiperen op veranderingen in het milieu, maar alleen daarop te reageren ). Verlies van gedrags-ritmiek is veel meer uitgesproken in DD en in het algemeen manifesteert in het totale verlies van 's morgens of' s avonds toppen van de bewegingsactiviteit (dwz willekeurige periodes van activiteit en inactiviteit), zoals te zien in per 0 vliegt (Figuur 3D). In aanvulling op het onderwijs grafieken, kunnen locomotorische activiteit gegevens worden weergegeven als dubbel-plot actogram (FaasX), waar twee dagen van data sequentieel worden uitgezet op elke lijn, maar de laatste dagen het profiel begint de volgende regel van twee dagen ter waarde van activiteit (figuur 4). Zo worden bijvoorbeeld LD1 en 2 uitgezet op de eerste regel van thij actogram. De volgende regel begint met een herhaling van LD2 en wordt gevolgd door LD3 en ga zo maar door. Naar aanleiding van dit formaat, is de locomotorische activiteit data verspreid over het hele experiment geïllustreerd in de actogram. Actograms kunnen worden uitgezet voor elke individuele vliegen, of voor elke vlieg genotype. Een voordeel van actograms meer dan onderwijs grafieken is dat een verandering in de periode lengte van de dagelijkse activiteit ritmes is gemakkelijk te observeren (Figuur 4). Naast het genereren van onderwijs grafieken en actograms, kan locomotorische activiteit van gegevens uit DD voorwaarde worden voorgelegd aan FaasX de periode lengte met behulp van een aantal verschillende programma's, waaronder Cycle-P te berekenen.
Analyse van de slaap / rust parameters: Door het gebruik van de huidige definitie van de slaap / rust in Drosophila (Hendricks et al. 2000.), Dat is vijf aaneengesloten minuten van inactiviteit, kan men analyseren van gegevens opgenomen van bewegingsactiviteit assays en meerdere slapen parameters met behulp van Insomniac onderzoeken (L. Ashmore), een Matlab-programma. Het percentage van de tijd die vliegt door te brengen slapen kan worden berekend op verschillende tijdstippen, bijvoorbeeld procent slaap elk uur (figuur 5A), of 12 uur (Figuur 5B). Andere, meer algemene slapen parameters die kunnen worden onderzocht onder meer betekenen rest bout lengte (figuur 5C) en wakker activiteit count (Figuur 5D). De gemiddelde slaap / rust bout lengte is een maat voor hoe geconsolideerde de slaap is en kan de kwaliteit van de slaap te illustreren. Wake-activiteit, zoals de naam suggereert, is een maat voor de activiteitsgraad bij de vliegen wakker zijn. Deze parameter helpt om onderscheid te maken tussen vliegen die echt worden beïnvloed in slaap / rust gedrag ten opzichte van degenen die ziek of hyperactief. Kan bijvoorbeeld vliegen die zijn gewoon ziek lijken meer slapen, omdat ze niet zo mobiel. Voor deze vliegen, zullen hun kielzog activiteit lager zijn ten aanzien van dieren te controleren.
Figuur 1: Stroomschema waarin de belangrijke stappen voor het testen bewegingsactiviteit ritmes in Drosophila De procedures worden gepresenteerd aan de linkerkant, terwijl behulpzame reacties zijn voorzien aan de rechterkant.. De hoeveelheid tijd die nodig is om de nodige kruisingen en genetische manipulaties uit te voeren om vliegen te verkrijgen met de juiste genotype voor specifieke experimenten is variabel afhankelijk van de aard en het ontwerp van het experiment. De twee stappen gemarkeerd met een sterretje (*) de tijd voor als volwassen vliegen moet worden gezaaid / gekoppeld aan nakomelingen van de geschikte leeftijd (1 tot 5 dagen oud) te genereren voor het experiment.
Figuur 2: aansluitschema ter illustratie van de verbindingen tussen de verschillende componenten voor Drosophila locomotorische activiteit het verzamelen van gegevens met behulp van de DAM-systeem is een speciale computer wordt gebruikt om de bewegingsactiviteit graven van Drosophila te nemen.. Activiteit monitoren zijn gehuisvest in incubators zijn uitgerust met temperatuur en verlichting (aan / uit) controle. De computer kan ook worden gebruikt om de timing van het licht aan / uit-controle in broedmachines als de stroombron van de verlichting kan worden aangesloten op de voeding (optioneel). De communicatie tussen de computer en activiteit monitoren / incubators worden beheerd door de Voeding interface-eenheid. De computer, Voeding en incubators (als de verlichting is onafhankelijk van de computer) zijn aangesloten op het stopcontact via de UPC om ononderbroken controle van de activiteit en de continue verlichting zorgen tijdens de lichte fase. Het wordt aanbevolen om alle elektrische apparaten aansluiten op de nood-back-up circuits in de faciliteit, indien beschikbaar.
Figuur 3:. Onderwijs grafieken gegenereerd met behulp van FaasX toont het dagelijks bewegingsactiviteit ritmes van de ritmische wild type vliegt (w per 0 vliegt het dragen van een per + transgen) (A en B) vs aritmische w per 0 mutanten (C en D) Man vliegt werden gehouden bij 25 ° C en meegesleepte voor 4 dagen in 12:12 LD (licht: donker) cycli, gevolgd door zeven dagen in DD (constante duisternis). Voor elke vliegen lijn, werden de locomotorische activiteit van individuele vliegen (n> 32) gemeten in 15-minuten bakken en vervolgens gemiddeld tot een groep profiel representatief voor die lijn te krijgen. A en C tonen de activiteit van gegevens die zijn gegenereerd uit het gemiddelde van de tweede en derde dag in het licht / donker cyclus (LD 2-3), terwijl B en D tonen de activiteit van gegevens die zijn gegenereerd uit het gemiddelde van de tweede en derde dag in constante duisternis (DD 2-3 ). Verticale balken staan voor de activiteit (in willekeurige eenheden), opgenomen in 15 minuten bakken in de lichtperiode (licht grijs) of de donkere periode (donker grijs). Horizontale balken aan de onderkant van LD onderwijs grafieken, wit, lichten op, zwart, licht uit. ZT0 en ZT12 vertegenwoordigen het begin en einde van de fotoperiode respectievelijk. Voor DD onderwijs grafieken; CT0 en CT12 reprESENT het begin en einde van de subjectieve dagen in constante donkere omstandigheden, aangeduid door de grijze balk. In paneel A, M = ochtendspits; E = avondspits. De pijlen in paneel A vertegenwoordigen anticiperend gedrag van 's morgens en' s avonds pieken waargenomen in wild-type vliegen, die afwezig zijn in w per 0 aritmische vliegen.
Figuur 4:. Double-plot actogram gegenereerd met behulp van de software FaasX illustreren bewegingsactiviteit gegevens van vliegen met wild-type, korte of lange termijn Man vliegt werden bewaard bij 25 ° C en meegesleepte voor 4 dagen in 12:12 LD cycli, gevolgd door acht dagen in constante duisternis (DD) voor de berekening van de vrije-looptijd (t) met behulp van Cycle-P in FaasX. Drie vliegen lijnen met wild type periode [w per 0; per +; per 0 mutant die per + transgen], lange periode [w per 0; per (S47A); per 0 mutant die per (S47A) transgene], en de korte periode [w per 0; per (S47D); per 0 mutant die per (S47D) transgen] worden hier getoond (Chiu et al. 2008.). X-as staat voor ZT of CT tijd in LD-of DD respectievelijk, en y-as vertegenwoordigt activiteit tellingen (arbitraire eenheden) samengevat in 15 minuten bakken. De rode gestippelde lijnen verbinden de avond pieken voor elke dag van de experimenten. Merk op dat tijdens LD de avondspits is 'gedwongen' om synchroon met de 24-uur LD-cyclus te behouden, terwijl in DD de vrijlopende periode kan afwijken van 24 uur. Voor bijvoorbeeld vliegt met korte periodes de timing van de avond activiteit zal eerder plaatsvinden op elke opeenvolgende dagen in DD (wanneer uitgezet tegen een 24-uurs tijdschaal, zoals hier afgebeeld), terwijl een verschuiving naar rechts is waargenomen voor vliegen met een lange periodes.
. Figuur 5: Kwantificeren slapen parameters in Drosophila Vliegen (Canton-S, CS) werden blootgesteld aan standaard 12:12 LD cyclus bij 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) werd gebruikt om de gegevens en Microsoft Excel werd gebruikt om de hitlijsten hier getoonde genereren proces. Minstens 70 vliegt werden samengevoegd tot de groep gemiddelden en error bars (standaardfout van het gemiddelde) getoond te verkrijgen. (A) Baseline slaap berekend elk uur, getoond is een representatieve dagelijkse cyclus. (B) Baseline slaap van de representatieve dagelijkse cyclus berekend per 12 uur. (C) Gemiddelde lengte van elke rust bout berekend in 12-uur stappen. (D) percentage van wakker activiteit berekend per 12 uur.
Discussion
In dit protocol beschrijven we de procedures voor het meten van Drosophila locomotorische activiteit ritmes, een betrouwbare gedrags-output van vliegen circadiane klokken die wordt gebruikt als standaard uitlezen van de klok functie. Deze test is gebruikt in grootschalige schermen voor de nieuwe klok mutanten (bijv. Konopka en Benzer 1971;. Dubruille et al. 2009) en wordt voortdurend gebruikt voor het ontleden en klokfunctie te begrijpen in vivo. Het is ook gebruikt om te slapen waak cyclus studie in vliegt, hoewel recente rapporten suggereren dat de digitale video-analyse is veel betrouwbaarder bij het kwantificeren van de slaap dan met behulp van de locomotorische activiteit ritmes (Zimmerman et al.. 2008). Bij het gebruik van de locomotorische activiteit ritmes in slaap te analyseren, het percentage van de slaap in de dag hebben de neiging om te overschatten.
Om ervoor te zorgen het succes en de reproduceerbaarheid van dit protocol, is het essentieel om te vliegen test die vergelijkbaar zijn in leeftijd, genetische achtergrond, en gefokt onder dezelfde voorwaarden, zoals gedrags-fenotypen in fruitvliegen, zoals circadiane ritmiek en slaap / rust-activiteit zijn erg gevoelig al deze factoren. Bij gebruik van meerdere incubators voor een experiment, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle couveuses zijn op de verwachte temperatuur, omdat sommige circadiane parameters kunnen veranderen als functie van de temperatuur. Een woord van voorzichtigheid bij het overwegen van de aankoop van incubators voor het werken met vliegen, ze zijn niet allemaal gelijk geschapen. Terwijl we aarzelen om een bepaalde eenheid zijn er vele opties aan te bevelen. Een goede bron voor het vinden van bedrijven die incubators verkopen voor Drosophila het werk wordt gegeven aan <www.flybase.org>. Sommige bedrijven verkopen zelfs "Drosophila circadiane 'incubators, waarin extra functies beschikbaar zijn, zoals nu al de bedrading voor de Trikinetics systeem en temperatuur aanloop (bijv. TriTech). Belangrijke functies omvatten de mogelijkheid om overdag licht-controle en een goede temperatuur in de fysiologische bereik van Drosophila (~ 15-30 ° C). Prijzen en maten van incubators variëren veel, maar met de nieuwere activiteit monitoren van Trikinetics, zelfs kleine incubators kan een groot aantal van deze apparaten tegemoet te komen. Ook, hoewel incubators met vocht controle kan worden gebruikt, toegevoegd element is niet nodig zolang je een kleine pan plaats met water om de luchtvochtigheid (50-70% is prima) te geven. Tot slot, hoewel we regelmatig FaasX en Insomniac te gebruiken voor data-analyse in dit protocol, zijn er alternatieve programma's en software beschikbaar (Rosato en Kyriacou 2006), bijvoorbeeld ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Rhythm Package (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), en MAZ (Zordan et al. 2007)..
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie NIH34958 naar I. E en NS061952 naar JC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
- Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
- Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
- Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
- Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
- Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).
