Summary
私たちは、毎日の運動活性のリズムを記録するための手順を説明します
Abstract
ほとんどの生命体は、内因性概日（≡24時間）ペースメーカーまたはクロックによって駆動される、細胞の生理学的および行動的現象で毎日のリズムを示す。人間の概日システムの機能不全は、数多くの疾患または障害に関連付けられています。容易に測定された行動のリズムが時計機能の読み出しとして使用されているそれによって概日リズムの根底にあるメカニズムの理解に向けた大きな進歩は、遺伝の画面から浮上している。 ショウジョウバエを用いた研究は、概日リズムの根底にある携帯電話や生化学的基盤の理解に精液の貢献をしてきた。読み出しショウジョウバエで測定された標準の概日行動は、自発運動です。一般的には、監視システムは、 ショウジョウバエの運動の動きを測定することができる特別に設計されたデバイスが含まれます。これらのデバイスは、暗室内にある環境的に制御されたインキュベーターに収容されており、小さな管の内側に含まれる個々のハエの自発運動を記録するために赤外光のビームの中断を使用してに基づいています。多くの日にわたって測定した場合、 ショウジョウバエでは、活動および非活動の毎日のサイクル、動物の内因性概日システムによって支配される行動リズムを示す。全体的な手順は、市販の自発運動の監視装置の出現とデータ解析のためのソフトウェアプログラムの開発を簡素化されています。我々はここで説明する手順で、現在世界中で使用される最もポピュラーなシステムですTrikinetics社、からシステムを使用してください。最近では、同一の監視装置は、 ショウジョウバエの睡眠行動を研究するために使用されています。多くのハエの毎日のウェイク睡眠サイクルを同時に測定し、連続的な自発運動のデータの1〜2週間価値があることができるため、通常は十分です、このシステムが変更さサーカディアンや睡眠の特性を顕在ショウジョウバエを識別するために大規模な画面に最適です。
Protocol
プロトコルの全体的なデザインを図1に示します。暗室内にある環境的に制御されたインキュベーター内に収容されたデバイスを使用して自発運動を監視するためのセットアップは、最初にアセンブルする必要があります。一度完成されている、システムは後続のすべての自発運動のリズムの測定で使用することができます。各実験では、一つは（iii）の負荷が活動のチューブに飛んで、（ⅱ）食料源を含むガラスの活動のチューブを準備し、トランスジェニック動物を生成したり、必要な十字架をセットアップに含めると、アクティビティモニターを接続する可能性のある、（i）は、実験動物を準備していますデータ収集システムへ、そして（iv）レコードと1つの検査に望んでいる概日または睡眠パラメータに応じて、異なるソフトウェアを使用してデータを分析する。ここで、我々は、監視装置にハエが最初の環境インキュベーターで所望の光/暗条件にさらされる時間として、実験の"スタート"を定義。
1。自発運動モニタリングシステムのセットアップ
- 監視システムは、データ収集装置（図2）にモニタリング機器を接続するためにそのような専門の監視装置、昼間の光の制御のための能力を持っている環境インキュベーター、データ収集装置、コンピューターや配線などの周辺材料等、多くの機器の項目が含まれます。 ショウジョウバエのアクティビティモニタリング（DAM）のデータ収集システムのインストール手順は、製造業者（Trikinetics社）によって提供されます。
- 運動活性のモニタリングシステムを収容するために、専用の暗室に、好ましくは、温度制御システムを装備した換気のよい場所を、選択してください。関係するすべての電気システムが（例えばコンピュータ、インキュベーター）小さくて狭い部屋の中で長時間にわたって実行されている状態で、過度の熱が室内の温度の急激な増加につながる生成することができます。そのため、インキュベータの温度と温度制御に失敗する可能性が高いを維持するために余分な負荷を負わされる。私たちも、風通しの良い部屋のため、夏にはエアコンからの移行が困難室温を維持するために作ることができる秋/冬で加熱することがわかります。このような場合、追加の換気は、過熱のリスクを軽減するために暗い部屋でインストールする必要があります。また、それは不要な熱の生産を最小限に抑えるために使用されていない保育器をオフにするのが最善です。
- 外部の光源から部屋を密閉する。入り口は回転ドアや黒いカーテンで密閉することができます。これは暗室に入る不要な光の可能性を最小限に抑えることが我々には、回転ドアを好む。暗室内では、それは果物が概日システムは（と緑/青の光に比べて、赤色光にあまり敏感である）赤外光に敏感ではない飛んで暗闇の中で完全に動作する必要はありません。我々は暗室で見る必要があるが、それでも全体的な暗さを維持するケース（例えば、すぐにその暗期にあるインキュベーターの監視デバイスを削除または追加）で、我々は単純に赤で覆われている標準的な懐中電灯を使用してくださいフィルター。あるいは、またはそれに加えて、あなたの暗室の蛍光灯を持っている場合、赤いフィルターペーパーでそれらをカバーしたり、フィルター紙で覆われたスタンドアローンの白熱デスクライトを持っている。それは赤い光の非常に短い暴露（数秒）に、暗所でハエを公開すると、その概日時計に影響を与える可能性はほとんどありません。また、 ショウジョウバエの概日システムは、可視光に非常に敏感ですが、我々は、暗室で光の小さなcreaksは必然的とは思わない。いかなる場合でも、良い習慣は、家のモニタにのみ開いているインキュベータの扉を維持することです必要。これはその光の位相をインキュベーターからの光にさらされ、その暗期でのインキュベーターの可能性を最小限にするとしても、一度に1つのインキュベーターを開く。
- 建物内のサージ、スパイク、または電源障害が発生した場合の電力のアクティビティの監視システムのコンポーネントを配置するのに十分なワット数の容量を持っている無停電電源装置（UPS）緊急バックアップユニットを購入する。利用可能な場合、建物の緊急バックアップ回路にUPSの緊急バックアップユニットを接続します。システムは非常用電源に切り替わると、機器が停電時に緊急のコンセントに差し込まれている場合でも、短い移行期間があることに注意してください。その移行の間に、さらに数秒間力の損失は、シャットダウンのコンピュータにつながることができますし、インキュベーター内のライトがオフにされている。したがって、活動データとインキュベーターの照明を制御するシステムを収集するために使用されているコンピュータがないだけ非常用電源にも、UPSにフックされていることを確認することが重要です。インキュベーター内で照明を制御するシステムが直接インキュベーター（ほとんどの場合それは）で規制されていない場合、それは出現にインキュベーターをプラグインするだけで十分です数秒のための電力の損失などの不都合NCYの電力は、チャンバ内の温度には影響しません。一般的にUPSデバイスにのみ電力がない状態で、機器が5〜30分のために実行し続けるということに注意してください。その主な目的は、非常用電源への定期的なからの移行時の電力が一時的に消失するのを防止することです。
- 完全にデータ収集および/またはインキュベーターの光を制御するための専用コンピュータ、PCまたはMacintoshを、設定します。 DAMシステムはすべての時間を実行すると無人になりますので、このコンピュータがクラッシュのリスクを最小限に抑えるために好ましくは、最小限のソフトウェアがインストールされていないネットワークに接続していないことをお勧めします。さらに、システムはその後の分析のために収集されたデータのダウンロードを可能にするため、移植可能なデータのストレージ、例えばZIPドライブ、CD / DVDライター、またはUSBが必要です。
- 手動でアクティビティモニタの目詰まり/抜き差しのしやすさを可能にするために、環境制御されたインキュベーターの棚の周りにきちんと電話回線網を手配する。標準の電話回線、アダプタ、およびスプリッタは、商用の電気店で購入し、使用することができます。彼らは一つのメインラインに収束し、コンピュータに接続するためのインキュベータから延長するような方法で複数の電話回線を設定します。
- 電話回線を介して電力にアクティビティモニター（Trikinetics社）を提供する電源インタフェースユニット（Trikinetics社から別名ブルーボックス）を介してコンピュータにインキュベータの内部監視装置を接続します。この電源はインタフェースユニットは、電話回線からUSBケーブルへの切り替え、データ転送用のインタフェースとして機能します。インキュベーターの光システムの電源ラインの電源コードが接続できるのと同じ単位、のオプションのライトコントローラは、コンピュータを介して概日インキュベーターの照明スケジュール制御を可能にするために使用できる。
- 電子デバイスやアヒルのテープまたはフリーランニングリズムを確保するために黒い布で不適切なシールインキュベータの扉のLEDからのマスク可能な光源が不要な光のない状態で測定されます。
2。実験動物の準備
- 果実における行動表現型は、概日リズムと睡眠/休息活動などの飛行試験動物の遺伝子型と年齢の違い（島ら、2006）に非常に敏感です。したがって、それは同じ環境条件で、同じ年齢の飼育されている適切な対照動物を使用してこれらの表現型を評価することが重要です。加えて、概日リズムにおける性的二形（ヘルフリック-フォスター2000）がある。一般診療は25℃と運動活性のアッセイのための古い5から1の間に一日で飼育されている成人男性のハエを使用することです。オスは産卵活動は自発運動の真の測定に影響するため、伝統的に使用されている代わりに、女性のハエの飛ぶ。のための性的二形が、時々女性のハエをアッセイすることは有益かもしれません。単純に5％スクロース、2％バクト寒天で構成される食品は、誤ったアクティビティーカウントを引き起こしてから開発し、孵化した幼虫の動きから非処女雌の卵を防ぐことができます。交配と処女雌（ヘルフリック-フォスター、J. Biol。リズム2000）との間の活動のプロファイルに違いがあるかもしれませんがまた、処女雌のショウジョウバエを使用することができます。
- 興味のある特定の変異ハエの概日とスリープ/残りのパラメータを調べるときに、それは、例えば、w1118またはYW同じ遺伝的背景の野生型株と変異株を異種交配するのが賢明です。これは、潜在的に概日リズムや睡眠/休息表現型をマスクする可能性が別のサイトの遺伝的修飾子を削除します。は交差ショウジョウバエ雄ではがないので、それは野生型の男性と変異体の雌を交配することによって異種交配を行うことをお勧めします。野生型株はまた、実験のための適切なコントロールとして機能します。種子は野生型の対照と約10〜14日運動活性リズムの実験の前に標準ショウジョウバエ食品に同時に変異ハエ（食品のレシピのためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターを参照してください。http://flystocks.bio.indiana.edu /）。子孫の羽化時には、1〜5日齢の雄性ハエを収集し、実験に使用するそれらを脇に置いておきます。
- このような過剰発現、RNAiの、そして世界中の異なる株式センターから入手可能な組織特異的なGAL4ドライバーのフライラインのような多数の遺伝子のツールやリソースと、それは、組織と時間的に固有の過剰発現やノックダウン特異的遺伝子の効果を分析することが可能です。方法（ブランドとPerrimon 1993; McGuireさんら2004;。。オスターヴァルダーら 2001）。このアプローチを使用して概日とスリープ/残りのパラメータを調べるために、組織特異的または薬剤誘導性のGAL4ドライバー（例えば男性）とのトランスジェニックコンストラクトを運んで飛んで（例えば、バージンの女性）UASレスポンダに接続された標的遺伝子をトランスジェニックコンストラクトを運ぶハエにクロスしています自発運動の開始前に約14日間実験。子孫の羽化時には、1〜5日齢の雄性ハエを収集し、実験に使用するそれらを脇に置いておきます。クロスに使用する親系統は、日常的に実験用のコントロールとして使用されています。 UAS応答者と同じ遺伝的背景の野生型のハエとGAL4ドライバーラインの交配からの子孫にも適切なコントロールです。
- としてステップ（2）で示され、（3）、実験動物の準備のために必要な時間の長さは大幅に実験の性質と設計によって異なります。トランスジェニック動物を生成する必要があるまたは交差スキームを実行する必要がある場合のケースでは、より多くの時間が当然必要になります。ロジスティックの理由から、それは25で約14日間かかります° ショウジョウバエのCは、卵から成体のハエに開発する。
3。活動のチューブの準備
- 活動の管は実験中にハエの生息地を表しています。一端に食品の物質が含まれているし、もう一方の端の糸やプラスチック製のプラグで接続さ5 mmのガラス管、彼らは（メモ、Trikineticsで測定するショウジョウバエの種に応じてさまざまなサイズを提供して直径約5mm）薄いです。ガラスのアクティビティ管が複数回再利用できるので、我々は出発点として、以前の実験から使用されて/汚れた活動のチューブを使用して準備手順を説明します。新しい活動のチューブを使用している場合は、単に（11）に進みます。
- それは、チューブ内部に食物が枯渇する傾向があり、4℃で保存されている残業場合でも、菌で汚染されるのでたてている活動のチューブを使用することが好ましい彼らは一般的に実験開始の前に数日ないしは1週間を用意しています。それらを準備する前に、各実験に必要なチューブの数を把握することが重要です。
- 使用される活動のチューブからプラグを（糸やプラスチック製のプラグ）を外し、大きなガラスのビーカーに入れます。チューブは、半分だけビーカーにいっぱいにしてください。水没チューブに確認して、水道水でビーカーを埋める。
- マイクロ波は水になるまでガラス管を水を入れたビーカーには、ワックスや寒天の食物を溶かすために完全な急激な沸騰に来る。
- 水がホットであることを注意してください。電子レンジからビーカーを取り出して、トラップされたワックスがトップにフロートするようにヘラやプラスチックを10mLのピペットでチューブをかき混ぜる。その後、ステップ（4）を繰り返す。
- 電子レンジからビーカーを取り出して、それが冷めるのを待ちます。 （それが使用可能な場合）低温室でビーカーを入れて、プロセスをスピードアップします。
- 水の温度が下がるように、ワックスは水の表面に収集し、徐々に凝固するだろう。単に手で固化したワックスを取り除く。これは、チューブ上でワックスのほとんどを取り除く必要があります。
- 新鮮な水道水を繰り返し行って（4）、（5）を持つ新しいビーカーに活動チューブを移す。
- ワックスのほとんどは、ステップ（7）で削除されているので、それが固化するワックスを待つ必要はありません。単にビーカーから水を注ぐと、別の新しいビーカーにチューブを移す。水がまだ熱いことはご注意ください。
- 手順（4）を繰り返し、（5）最後の時間。ビーカーから水を注ぎ、冷却するための活動のチューブを待ちます。
- 250mLのまたは500ミリリットルのガラスビーカーの中に垂直にそれらをロードする。彼らはあまりにも密集していないことを確認してください。ドライサイクルでオートクレーブを使用してそれらを殺菌したり、単にチューブを乾燥させる乾燥炉を使用してください。
- これとは別に、活動のチューブ内にロードするために食糧を準備するために、蒸留水または水道水で5％ショ糖（シグマ）、2％バクト寒天（BD）の溶液を作る。ソリューションを殺菌するためにオートクレーブ。オートクレーブした食品は、長時間にわたって直ちに使用または4 ° Cで保存することができます。食べ物が凝固すると、1つは、電子レンジが必要とチューブを埋めるためにそれを液化される。食べ物の未使用部分は保存され、後日使用することができます。
- 食べ物は、理想的には約65 ° Cの活性管を充填するのに使用するときにする必要があります。それはあまりにも高温になっている場合、あまりにも結露がチューブ内に蓄積されます。それは十分に熱くされていない場合、食べ物はチューブが均一に充填される前に固化される。食物と一緒に活動のチューブを埋めるまで、食品のソリューションは、下からの活動のチューブをいっぱいにできるように、ガラスのビーカーの内壁に沿って流動食のソリューションをピペッティングを10 mLのピペットを使用して、チューブが3分の1になるまで埋めソリューションと。特に、すべてのチューブ、ビーカーの中央にあるものを、確かめるために静かに周りの渦巻きビーカーを均一に食品液で満たされている。室温または4℃でどちらかを完全に固化するために食べ物を待ちますガラス管の内部に結露が放散されると次のステップに進みます。
- ビーカーから活動のチューブを削除するには、そのビーカーの底に向かってチューブを押すと同時にチューブをねじってそのチューブ内凝固食品と底ビーカーから分離します。好ましくは単束として、ビーカーからチューブを取り出してください。
- チューブの外表面に余分な食べ物を除去するためにチューブペーパータオルで一つずつを清掃してください。清潔な容器にチューブを脇に置きます。
- 管ホルダーなしで一般的な実験室ブロックヒーターを取ると強いアルミ箔のいくつかの層でも注意深く加熱をカバーしています。溶けてもアルミが並ぶ加熱にパラフィン（蝋）ペレットを追加。
- 非食料最後にチューブを保持し、溶融ワックスに食品の端を浸し。ワックスの凝固速度を上げるために冷たい水の入ったガラスビーカーにワックスを掛けられた部分をつけます。一回繰り返します。水の中にワックスチューブを浸漬すると、くっつかないからチューブを防止します。
- チューブは、すぐに使用、または4℃で週間以内に使用するための気密容器に保存することができます。長期記憶は、食品の過度の乾燥につながる。チューブを4℃で保存されている場合、使用前にベンチの上にそれらを残すことによって周囲温度にそれらをウォームアップすることを確認してください。
4。アクティビティのチューブと運動活性のモニタリングシステムにハエのロード
- 活動のチューブにハエをロードする前に、アクティビティモニタを収納するために使用するインキュベーターをオンにします。インキュベーターのコントロールを使用して温度を調整し、目的の実験計画にしたがってDAMシステムの光コントローラまたはインキュベーター独自の光制御システムを使用して光/闇政権を設定します。活動のチューブにハエをロードするために必要な時間は、安定させる温度では十分なはずです。
- 二酸化炭素でハエを麻酔。
- 静かに活動チューブに単一のフライを転送するために微細な絵筆を使用してください。
- 細かいピンセットを用い、半インチの周りにある糸の一枚の真ん中をつかんで、開口部を差し込むと、実験中に逃げるからハエを防ぐために、活動のチューブの非食品の端に糸を挿入し、同じ時間にチューブに空気の流れを可能にする時間。また、小さな穴（Trikinetics、株式会社）とプラスチック製のキャップは、開口部を閉じるために使用することができます。
- ハエが目覚め、または他の食品に引っ掛かってハエの危険性があるまで、チューブをその両側に配置されていることを確認してください。
- アクティビティモニターにチューブを挿入します。 Trikineticsモニターの新しい、よりコンパクトなモデル（Trikinetics DAM2とDAM2 - 7）と、それは、赤外線ビームが中央の位置でチューブを通過することを保証するために輪ゴムと場所でチューブを保持する必要があります。
- インキュベータへのアクティビティーモニターを配置し、電話線を介してデータ収集システムにそれらを接続する。すべてのモニタが適切にフックアップされ、データがそれらの各々から収集されていることを確認するDAMシステム収集ソフトウェアを使用して確認してください。モニターは、それぞれのガラスの活動のチューブの中心を介して赤外光ビームを発する。ハエの自発運動は、"一つは"赤外線ビームが遮られたり、"ゼロが"赤外線ビームが遮断されていない記録されるたびに記録され、生のバイナリデータとして記録されます。
5。概日周期と振幅の測定のデータを記録する実験的なデザイン
- ハエは2〜5日間フルに希望の光/暗（LD）と温度政権にそれらを公開することによって同期され、連行されています。最も一般的に使用されるエントレインメントの条件は25℃（12:12 LD）の光/ 12時間暗12時間の明/暗サイクル℃です。この一般的に受け入れられている標準的な条件は本質的にショウジョウバエがアフロ赤道の場所から発信されたという考えに基づいています。概日リズムを勉強するときに一ニーズに精通すること、いくつかの用語がある。このプロトコルに関連する、ライトがインキュベーター内に行く時間がzeitgeber時間0（ZT0）とその値（例えば、午前12時12分LDサイクルにおける相対的な他のすべての時間として定義されている、ZT12は時間のとき灯）がオフになっています。標準の12時12分LD条件下で、野生型キイロショウジョウバエは、通常、活動の2発作を示し、"朝"のピークと"夜"のピーク（図3A）と呼ばれるZT12の周りを別と呼ばれるZT0を中心にひとつ。朝と夕方の発作は、内因性のクロックで制御されていて、光/闇の遷移に応答して、活動の一時的なバーストな"驚愕"の回答もありますされています。エントレインメントの二日間は最小であり、より多くの時間がかかるものと一定の暗闇の中でフリーランニングの期間（下記参照、ステップ2）を測定することに向けられて大画面で、例えば、使用することができる。あなたが毎日の明暗サイクルの間の活動パターンの研究に興味を持っている場合は、、それはより多くのデータを得られるようにLDの4〜5日間ハエを維持することが望ましい。基本的に、ハエの数や最終的なデータの分析（例えば、最後の二つからプールのデータでLDの日数を増やすLDの運動活性の価値がある間は）、より信頼性の日周活動のプロファイルと測定値（例えば、朝または夕方のピークのタイミング）が生成されます。また、活動の毎日の分布は、日長（日長）と温度の関数として変化する。一つ勉強したい場合は標準から光周期または温度を変化させる主な理由は、日常の活動パターンは、季節適応（。例えばChen ら 2007）受ける方法をショウジョウバエにも、毎日の温度サイクル（例えば、グレイザーとStanewsky 2005同伴することができます。 Sehadova ら 2009）。たった2-3によって異なる温度サイクル° C同調の活動のリズムに十分である。
- 連行期間が終了した後にフリーランニング運動活性リズムは、（上記参照、ステップ1）恒暗及び温度条件で測定されています。ライトサイクルの設定は、実験のその後の日は、DDの最初の日を表すようにLDの最終日に暗期でいつでも変更することができます。 DDのデータ収集の七日には、ハエの概日周期と振幅（例えば、リズムの力や強さ）を計算するのに十分です。一般的には、少なくとも16ハエのサンプルサイズは、特定の遺伝子型の信頼性の高いフリーランニング期間を得ることが必要である。一つだけ日内活性を測定することに関心がある場合でも、内因性の期間の変更はLDの活動の毎日の分布を変えることができるようにDDのハエのフリーラン周期を測定するために最善のままです。例えば、長い内因性周期で飛ぶには、通常（例えば、図4を参照）LDにおける遅延夕方のピークを示す。
- 実験の終了時に、生のバイナリデータは、DAMシステムのソフトウェアを用いて収集ポータブルデータストレージデバイス、例えば、USBキーにダウンロードされます。
- スリープ/残りのパラメータを解析する際に概パラメータ、または1〜5分のビンを分析する際に、生のバイナリデータは、DAM Filescan102Xを（Trikinetics、（株））を使用して処理され、15と30分間のビンに加算されます。現在、非アクティブの5つの連続した分は、 ショウジョウバエの睡眠/休息の標準的な定義です（ヘンドリックスら2000;。ホーとSehgal 2005）。
- DAMシステムで収集されたデータを分析するために、私たちが唯一の日常私たちのラボで使用されるこれらのメソッドを提供する多くの異なった方法があります。 Microsoft Excelが別のサンプル群に遺伝子型を割り当てるために使用されます。 FaasXソフトウェア（M. BoudinotとF. Rouyer、センター国立デラルシェルシュ科学研究、GIF - sur - YvetteのCEDEX、フランス）や不眠症は（MATLABベースのプログラム、レスリーアシュモア、ピッツバーグ大学、ペンシルバニア州）概日を調べるために使用されます（例：期間および電力）またはスリープ/残り（例えば、百分率の睡眠、長さが試合残りを意味する）のパラメータをそれぞれ。
6。代表的な結果
このプロトコルの完了時に、一つは対照動物にrelationの実験動物の概日と睡眠の両方のパラメータを調べるために同じデータセットを使用することができます。
概パラメータの解析：LDまたはDD条件で数日間にわたって毎日運動の活動やハエの平均活動を示す教育のグラフは、FaasXを（図3）を使用して生成することができますキイロショウジョウバエは、一般的活動の2発作を示す、一つはZT0（またはCTを中心に。 ）"朝"のピークとZT12（CT 12）と呼ばれる"夕方"ピークの周りを別と呼ばれる。活動のこれら二つの発作は、内因性のクロックによって制御され、さらにはフリーランニングDD条件（図3B）で観察することができます。これらのアクティビティのピークのタイミングでの変更は簡単に教育のグラフで観察することができますし、内因性時計の特性の変化を示すことがあります。適切なクロック機能の指標となる別のプロパティには、実際の暗い - 光または光 - 暗闇の遷移（図3A、矢印）の前に発生したLDサイクルで観察された自発運動に先行増加である。この動作は明らかに野生型のハエ（図3A）で認められたが、そのような0（図3C）（Konopkaとベンザー、PNAS、1971） あたりのような不整脈の変異体には存在しないです。 当たり0変異体の場合には、LDで観測された"朝"と"夜"のピークは、明/暗条件の急激な変化（つまり、"クロックレス"ハエの環境変化を先取りではなく、単にそれらに反応しないのために純粋な驚愕反応です。 ）。行動リズムの消失は、DDでより顕著であり、一般的に当たり0ハエ（図3D）に見られる自発運動の朝または夕方のピークの合計損失（活動および非活動のすなわちランダム発作）、中に現れます。教育のグラフに加えて、自発運動のデータデータの二日間は、各ラインに順次プロットが、最終日のプロフィールは、アクティビティの2日分の次の行を開始する（図をしているダブルプロットactogram（FaasX）、のように表すことができます。 4）。例えば、LD1と2はtの最初の行上にプロットされています彼actogram。次の行は、LD2の繰り返しで始まり、LD3とそれに続いています。この形式に続いて、実験全体にまたがる運動活性のデータがactogramに示されています。 Actogramsは、個々のフライ用、または各フライの遺伝子型に対してプロットすることができます。教育のグラフ上actogramsの一つの利点は、日常の活動リズムの周期長の変化は（図4）容易に観察可能であるということです。教育のグラフとactogramsを生成する以外にも、DDの状態から自発運動のデータは、サイクル- Pを含むさまざまなプログラムの数を使用して、期間の長さを計算するためにFaasXに提出することができます。
スリープ/残りのパラメータの解析：非アクティブの5つの連続した分であるショウジョウバエ（。ヘンドリックスら 2000）、の睡眠/休息の現在の定義を使用することにより、1つは運動活性のアッセイから記録されたデータを分析し、不眠症を使用して複数の睡眠パラメータを調べることができます。 （L.アシュモア）、Matlabのベースのプログラム。寝て過ごす飛ぶ時間のパーセントは、例えば、％はすべての時間（図5A）、または12時間（図5B）スリープ異なる時間間隔で計算することができます。平均長さが試合残り（図5C）とウェイクの活動の数（図5D）を含む検査することができる他の多くの一般的な睡眠パラメータ。長さは試合睡眠/休息は睡眠がいかに連結の尺度であることを意味し、睡眠の質を示すことができます。ウェイク活動は、その名前が示すように、ハエが目を覚ましている活動の速度の尺度になります。このパラメータは、本当にどちら病気または活動過多であるもの対睡眠/休息行動に影響を受けているハエを区別するのに役立ちます。例えば、単純にうんざりしているハエは、彼らは携帯電話ではないので、もっと寝ているように見えることがあります。これらのハエの場合は、それらの航跡の活動は、動物を制御するために関連して低くなります。
図1：。有用なコメントが右側に用意されている間、 ショウジョウバエで自発運動のリズムを測定するための主要な手順を概説したフローチャートの手順は、左側に表示されます。特定の実験のために右の遺伝子型でハエを得るために必要な交配と遺伝子操作を実行するために必要な時間は、実験の性質や設計に応じて可変である。アスタリスク（*）が付いている2つのステップが大人のハエが実験のために適切な年齢の子孫（1〜5日齢）を生成するシード/交配させる必要があるとき、時間枠を提供しています。
図2：DAMシステムを用いてショウジョウバエの運動活性のデータ収集のためのさまざまなコンポーネント間の接続を示す結線図を専用のコンピュータは、 ショウジョウバエの運動活性のカウントを記録するために使用されます。アクティビティモニターは、温度と照明（オン/オフ）制御を搭載したインキュベーター内に収納されています。コンピュータは、照明システムの電源が電源ユニット（オプション）に接続可能かどうインキュベーターで光のタイミングをオン/オフ制御に使用することができます。コンピュータと活動のモニター/インキュベーター間の通信は、電源のインターフェース単位で管理されています。コンピューター、電源ユニットとインキュベータは（照明制御はコンピュータとは独立している場合）光フェーズでの活動の中断のない監視と継続的な照明を確保するためにUPCを経由してAC電源コンセントに接続されています。それは可能な場合、施設での緊急バックアップ回線にすべての電化製品を接続することをお勧めします。
図3：教育FaasXがリズミカルな野生型のハエの毎日の運動活性のリズムを示す（0当り wが当たり+導入遺伝子を運ぶ飛ぶ）（AとB）対不整脈ワット当たり0変異体（CとD）を使用して生成された男とハエが保管されたグラフ 25℃と12時12分LD（光：暗い）で4日間連行DDの7日間（一定の暗さ）に続くサイクル。各フライラインの場合は、個々のハエ（N> 32）の運動活性のレベルは、15分ビンで測定し、そのラインのためのグループプロファイルの代表者を得るために平均化した。とCはBとDは（DD 2-3定数暗闇で2番目と3番目の日数を平均から生成されたアクティビティデータを表示しながら明/暗サイクルで2番目と3番目の日（LD 2-3）平均から生成されたアクティビティデータを表示）。縦棒は、明期（ライトグレー）または暗期（濃い灰色）の間に15分のビンに記録された活動を（任意の単位）を表します。 LDの教育のグラフの下部にある水平のバーは、白、ライトオン、黒、ライトオフ。 ZT0とZT12は、それぞれ光周期の開始と終了を表します。 CT0とCT12一つのrepr、DDの教育のグラフの灰色のバーで示さ恒暗条件下における主観的な一日の始まりと終わりを、ESENT。パネルで、M =朝のピーク、E =夕方のピーク。パネル内の矢印は、0不整脈ハエ当たり wに存在しない野生型のハエで観測された朝と夕方のピークの先読み行動を表しています。
図4：野生型、短期、または長期でハエの自発運動のデータを示すFaasXソフトウェアを使用して生成されたダブルプロットactogram男とハエを8に続いて25℃で保持し、12時12 LDサイクルで4日間連行された。 FaasXでサイクル- Pを使用して自由継続周期（t）の計算のための一定の暗闇の中で日（DD）。野生型の周期を持つ3つのフライライン[0あたりの W;当たり+; 当たり0変異+遺伝子ごとに実施し]、長い期間[0あたりの W;あたり（S47A）、0あたりの変異体（S47A）導入遺伝子ごとに運ぶ]、および短期間[W 0当たり 、（S47D）当たり、当たり運ぶ変異体0（S47D）あたりの導入遺伝子は]（。チウら 2008）ここに表示されます。 X軸は、それぞれ、LDやDDでZTまたはCTの時間を表し、Y軸は、15分ビンに加算アクティビティーカウント（任意の単位）を表します。赤い点線は、各実験日の夕方のピークを接続します。 LDの間に夕方のピークが自由継続周期は24時間から逸脱することができますDDのに対し、24時間LDのサイクルと同期を維持するために"強制"されていることに注意してください。右へのシフトが長いとハエのために観察されるのに対し、例えば、短期間でハエのために夜の活動のタイミングは、DDのそれぞれの連続した日（以下に示すように、24時間の時間スケールに対してプロットしたとき）に、以前発生しますピリオド。
図5： ショウジョウバエの睡眠パラメータを定量化するハエ類（カントン- S、CS）は、25℃で標準の12時12分LDサイクルにさらされた不眠症（L.アシュモア）がデータを処理するために使用され、Microsoft Excelは、ここに示されているチャートを生成するために使用されていました。少なくとも70ハエが示すように、グループの平均値とエラーバー（平均の標準誤差）を取得するためにプールした。 （A）時間ごとに計算されたベースライン睡眠、示されては、代表的な一日のサイクルです。 （B）代表的な日常のサイクルのベースラインの睡眠は12時間ごとに算出。 12時間単位で計算されたそれぞれの残りの試合の（C）の平均の長さ。 （D）目覚める活動の比率は、12時間ごとに算出。
Discussion
このプロトコルでは、我々はショウジョウバエの自発運動のリズム、時計機能の標準的な読み出しとして使用されるフライ概日時計の信頼性の高い行動出力を測定するための手続きについて説明。このアッセイは、新規クロック突然変異体の大規模スクリーン（。などKonopkaとベンザー1971; Dubruille ら 2009）で使用されており、継続的に生体内での時計機能を細かく分析し、理解するために使用されます。また、最近の報告では、ビデオ、デジタル分析は、自発運動のリズム（Zimmerman氏ら、2008）を使用するよりも睡眠を定量化するには、はるかに信頼性があることを示唆していても、ハエの睡眠覚醒のサイクルを研究するために使用されています。睡眠を分析するために自発運動のリズムを使用する場合は、昼間の睡眠の割合が過大評価される傾向にある。
果物の行動表現型はそのような概日リズムと睡眠/休息活動として飛んでこのプロトコルの成功と再現性を確保するために、それは、年齢、遺伝的背景の類似しているアッセイハエに重要である、と同じ条件で飼育することは非常に敏感です。これらすべての要因に。単一の実験のために複数の保育器を使用する場合、それはいくつかの概日パラメータが温度の関数として変更される可能性があるので、すべてのインキュベーターでは、予想される温度であることを確認することが重要です。注意の1ワードハエを操作するための保育器の購入を検討し、すべてが平等ではないが作成されます。我々は多くのオプションがある特定のユニットをお勧めすることを躊躇しながら。 ショウジョウバエの仕事のためにインキュベーターを販売する会社を見つけるための優れたリソースは<www.flybase.org>で提供されています。一部の企業は、さらに追加機能は、すでにTrikineticsシステムと温度のランプ（例えば、Tritech）のために配線のような利用可能な特徴、" ショウジョウバエ概日"インキュベータを販売。重要な特徴は昼光制御とショウジョウバエの生理的な範囲で優れた温度制御のための機能が含まれています（〜15〜30℃）。保育器の価格とサイズは、多くの変化がTrikineticsから新しいアクティビティモニターで、さらに小さなインキュベーターは、これらのデバイスは、かなりの数を収容することができます。もし湿度（50〜70％で結構です）を提供するために、水で小さなパンを置くとしても、湿度が制御されているインキュベータを使用できますが、この追加機能は限り必要ありません。最後に、我々が日常的にこのプロトコルではデータ分析のためにFaasXと不眠症を使っているが、利用可能な別のプログラムやソフトウェアが（Rosatoとキリアコウ2006）がある、などClockLab（ActiMetrics）、ブランダイスのリズムパッケージ（D.ウィーラー、ベイラー医科大学、ヒューストン）、とMAZ（Zordan ら、2007）。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、JCにI. EとNS061952にNIHの助成金NIH34958によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | DAM2 or DAM5 | DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator |
| Power supply interface unit (for DAM system) | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PSIU9 | Includes PS9-1 AC Power Supply |
| Light controller | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | LC6 | |
| Pyrex glass tubes | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | PGT5, PGT7, and PGT10 | |
| Plastic activity tube caps | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | CAP5 | Yarn can be used instead of plastic caps. |
| DAM System data collection software | Trikinetics Inc.; Waltham, MA | Versions available for both Mac and PC | |
| FaasX software | Centre National de la Recherche Scientifique | Only for Mac | |
| Insomniac 2.0 software | University of Pittsburgh School of Medicine | Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh. | |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator | Percival Scientific, Inc. | I-30BLL | Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm |
| Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature | Tritech Research, Inc. | 05DT2CIRC001 | Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm |
| APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) | APC | SU2200NET | Output Power Capacity of 1600 Watts |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| TissuePrep Paraffin pellets | Fisher Scientific | T565 | Melting point 56°C-57°C |
| Block heater | VWR international | 12621-014 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).
- Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock. Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).
- Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses. PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).
- Glaser, F. T., Stanewsky, R. Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Ho, K. S., Sehgal, A. Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep. Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).
- Konopka, R. J., Benzer, S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, 384-391 (2004).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Rosato, E., Kyriacou, C. P. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).
- Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64, 251-266 (2009).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. In Circadian Rhythms Methods and Protocols. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).
