Summary
Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für Kirchenfenster
Abstract
Mehrere bekannte morphogenetischen Gradienten und zelluläre Bewegungen treten entlang der dorsal / ventral Achse des
Protocol
1. Imaging-Methodik
- Melt Glyzerin-Gelatine in einem 55 ° C Grad Wasserbad für 20-30 Minuten, bis es eine homogene Flüssigkeit wird. Swirl, aber nicht die Flasche schütteln, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Während das Gelee schmilzt, eine dünne Schicht von Glycerin mit einem Kimwipe auf einen sauberen Glasobjektträger (optional).
- Pipette 1 bis 1,5 ml geschmolzenem Glyzerin-Gelatine mit einem Schnitt P1000 Pipettenspitze auf der Oberfläche der Folie, um eine dünne erste Schicht zu erzeugen. Pipette vorsichtig, um Blasen zu vermeiden.
- Lassen Sie das Gelee erstarren für 5 min auf einer horizontalen Fläche, dann die Folie bei -20 ° C für 5 min und fahren Sie mit Embryo Ausrichtung. Alternativ Abdeckung der Folie mit Saran Wrap und legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 5 Tage.
- Pipette einen kleinen Tropfen gefärbten Embryonen in 70% Glycerin / PBS oder andere Antifade Glycerin-Basis Montage Medien (zB Slowfade oder Vectashield) auf der Seite des Gelee Betten.
- Begin pre-Ausrichtung der Embryonen, die durch individuell ihre Übertragung aus dem Drop auf das Gelee Oberfläche. Übertragen Sie sie mit einer schrägen Injektionsnadel, mit dem schrägen Seite wie ein Löffel.
- Rund Ort des Embryos entlang von 2 bis 3 Spalten. Wenn ein Embryo in die Nadel stecken bleibt, rühren Sie ihn in der Dropdown mit den anderen Embryonen, um sie freizugeben. Verschwenden Sie keine Zeit sorgfältig richtet sie an dieser Stelle. Lassen Sie etwas Platz zwischen den Spalten.
- Richten Sie die Embryonen, indem sie horizontal auf dem Gelee Medium mit Hilfe der Injektionsnadel. Während Sie, richten Sie die Köpfe und Schwänze in die gleiche Richtung. Machen Sie sie parallel zueinander entlang der Spalte. Entfernen Sie überschüssiges PBS Glycerin als einen Weg mit einem Stück gedreht Kimiwipe links.
Hinweis: Überschüssige Glycerin verursacht Embryonen zu locker eingeschlossen in Gel, wodurch die Trennung der beiden Gelee Schichten, so dass es schwierig zu schneiden und zu montieren. Umgekehrt wird das Entfernen zu viel Glycerin trocken und flach Embryonen. - Verwenden Sie einen Schnitt gelber Spitze, eine dünne Schicht von Gelee über die Embryonen (50-150 ul, je nachdem wie viele ausgerichtet wurden) zu verbreiten.
- Legen Sie gleiten in -20 ° C Gefrierschrank für 10-20 min oder lagern Sie es bei 4 ° C über Nacht. Stellen Sie sicher, das Gelee ist völlig starr vor dem Schneiden. Andernfalls wird der Block von Embryonen sehr schwierig sein, Verbrauchsteuern. Die besten Ergebnisse für das Schneiden sind am nächsten Tag erhalten.
- Unter einem Binokular, verwenden Sie eine Rasierklinge vollständig durchschnitten das Gelee auf beiden Seiten der ausgerichteten Embryonen. Halten Sie die Rasierklinge in einem 90 ° Winkel gerade Schnitte zu machen. Die Schnitte sollten sehr nahe an den vorderen und hinteren Pole des Embryos in der Nähe, um überschüssige Gelee, das Bildgebung behindern könnten vermieden werden.
- 100-200 ul kalter PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) neben der Schnitte und sorgfältig abkratzen das Gelee zwischen Embryonen mit einem Spatel.
Hinweis: Das Waschmittel in PBT hilft das Entfernen des Gelee aus der Folie ohne Beschädigung des Embryos. - Mit einer Nadel, übertragen Sie die Block-Gelee mit eingebetteten Embryonen zu einem sauberen Objektträger zur weiteren Schnitt. Cut kleinere Blöcke mit 5-7 Embryos. Verwenden Sie PBT, um leicht die Gelee-Block zu bewegen. Alternativ, setzen Sie den Block auf einer trockenen Glasoberfläche zu lassen, um das Glas, das mehr Stabilität für präzise Beschneiden der Gelee, wenn nötig schafft befestigen.
- Flip aufrechte die Embryonen in die Gelee mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Nadel eingebettet. Für die Visualisierung unter dem Mikroskop, die entweder mit einem der beiden unten angegebenen Schritte aus, abhängig von der Art des Stativs verwendet wird.
- Inversen Mikroskop: Platz beendete Embryo Blöcke auf einen langen Deckglas mit Embryonen in eine aufrechte Position. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Embryos mit der geringsten Menge von Gelee wird in engeren Kontakt mit Ziel sein.
- Aufrechten Mikroskop: make zwei Stapel mit vier Nr. 1 Deckgläser mit Sekundenkleber verklebt als "unterstützt" verwendet werden und statt der Embryo-Block in Glycerin zwischen den "unterstützt". Brücke der Stapel mit einem langen Deckglas.
- Für konfokale Analyse, Überprüfung der Arbeitsabstand der Ziele, die verwendet werden, um herauszufinden, ob man sich vorstellen kann den ganzen Weg durch den Embryo oder nur teilweise. Zum Beispiel, D. melanogaster Embryonen ~ 0,55 mm in der Länge und kann vollständig abgebildet werden mit Hilfe eines Zeiss 20x Plan-Apo oder 40x LD Neo-Fluor Ziel. Die folgende Website bietet Informationen zu verfügbaren Zeiss Ziele und gibt Ihnen die Möglichkeit, Ziele nach Arbeitsabstände Suche: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. Repräsentative Ergebnisse
Da die Embryonen links intakt sind, kann diese Methode verwendet, um präzise Messungen der Embryo Größe und Abstände zwischen Genexpressionsmuster ergreifen. In Abbildung 1 zeigen wir eine Blastodermstadium Embryonen mit der Kernfärbung DAPI (blau), Anti-Dorsal-Protein (rot), sog mRNA (gelb) und sna mRNA (grün) gefärbt. Morphologische Verarbeitungses kann wie Invagination des Mesoderms (Abb. 2A, B) und die Migration von mesodermalen Zellen (Abb. 3 und 4) visualisiert werden mit dieser Methode. Verschiedene Z-Positionen entlang der DV-Achse kann durch Änderung der Fokusebene erhalten werden, wie in den Abbildungen 2-4 dargestellt.
Abbildung 1. Upright optische Scheibe eines intakten Embryos in Blastodermstadium. Doppelfärbung für mRNA und Protein. Ziel-mRNAs für in situ Sonden (sog und SNA) und Protein, das von primärer Antikörper (anti-Dorsal) gefärbt sind in der Figur angedeutet. DAPI wurde verwendet, um die Kerne Etikett. Beachten Sie, dass die Expression des sog und sna apikal sind im Zytoplasma lokalisiert, während die Expression von Dorsal ist die Kernkraft. Starke Signale aus sog entstehenden Transkripte, die in den Kernen liegen auch bei dieser Vergrößerung zu sehen.
Abbildung 2. Upright Bildgebung von einer intakten gastrulating Embryo. MRNA-Sonden verwendet werden und ihre jeweiligen Farben sind in der Figur angedeutet. A) Beachten Sie, dass in dieser Phase drei Gene mit gleicher Fluor (SNA, sog und dpp, in grün), gefärbt sind in räumlich getrennten Bereichen zum Ausdruck gebracht. Die einstülpende Mesoderm drückt sna, drückt die Neuroblasten Schicht ind und dem Ektoderm drückt dpp, während sog Ausdruck ist noch im ventralen Regionen des Nervensystems. B) In einem tieferen konfokalen Ebene des gleichen Embryos, bemerken wir die Basis des einstülpende Mesoderm stark drückt sna, aber die apikale Region drückt unteren Ebenen.
Abbildung 3. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo mit Keimstreifs erweitert sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. A) Focal-plane in der Nähe Embryo Kopf. B) Ein weiterer Schwerpunkt Flugzeug in den Kofferraum Region gleichen Embryos. Hinweis Masse von Mesodermzellen vor seitlichen Migration (vgl. Abbildung 4) liegen in der Nähe der ventralen Mittellinie auf beiden Seiten ein Keim-Band erweitert Embryo. Delaminierenden Neuroblasten sind in grün (ind und SNA) gekennzeichnet.
Abbildung 4. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo während Keimstreifs Erweiterung sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). A) Man beachte die Delamination Neuroblasten aus dem Epithel (Pfeil), gebeizt sowohl für ind und sna in dieser Phase (grün). Beachten Sie auch die beschränkte Expression von sog an der ventralen Mittellinie (gelb). Expression von dpp in diesem Stadium kann bei der lateralen Seite des Embryos (Stern) zu sehen. B) Optische Abschnitt in der gleichen Embryo in A am Ende des Embryos Länge, die bis Mitte hinteren Bereich entspricht gezeigt. Die ventralen Mittellinie Zellen sind für die sog gefärbt.
Discussion
Unter Querschnitt Bilder von Drosophila Embryonen kann eine Herausforderung sein, da sie entweder eine sorgfältige Hand Dissektion der Scheiben 2 oder die Verwendung von eingebetteten Medien für Mikrotom Verarbeitung, die in der Regel nachteilig für fluoreszierende Färbungen benötigt. Alternativ können Z-Stapel in einem konfokalen Mikroskop verwendet werden, um 3D-Rekonstruktion von Schnittbildern zu machen. Es ist jedoch zeitaufwendig, mehrere dünne Scheiben Confocal für eine genaue 3D-Rekonstruktion und Bleichen Problematisch wird machen. Ein weiteres Problem bei der Abbildung Embryonen, die in Längsrichtung montiert sind die Lichtstreuung, die bei Erreichen tieferen Abschnitte des Embryos, die auch erschwert unter präzise Messungen der Fluoreszenz-Signale für die Zwecke der Quantifizierung von Proteinen oder mRNA-Expression Level 1 erfolgt ist. Selbst mit einem Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop, ist die Lichtstreuung noch ein Anliegen wegen der Undurchsichtigkeit der Dotter Material in der Mitte des Embryos, die Auswahl der Montage Medien für eine optimale Transparenz der Probe zu begrenzen lässt.
Um diese Probleme zu umgehen, eine neue Technik namens "End-on" imaging der Positionierung Embryonen vertikal wurde vor kurzem zum Bild sowohl live als auch feste Proben 4 entwickelt. In diesem Papier haben wir ein neues Protokoll für vertikal montierte Embryonen, die eine einfache Erstellung und Visualisierung von festen Embryonen oder Gewebe von beliebiger Größe und Form, die mit mehreren in-situ-Sonden 3 gefärbt werden können. Unsere Methode besteht in der Verwendung einer Montageplatte Medien mit gelartige Konsistenz, die zur Ausrichtung Embryonen darin einzuhüllen ist. Cut Blöcke dieser Montage Medien mit eingebetteten Embryonen aufrecht vor der Belichtung in jeder Art von konfokalen Mikroskop positioniert werden.
Durch die Einbettung der Embryonen in die Gallerte und die Positionierung vertikal, sind wir in der Lage, horizontale Querschnitte nehmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, in denen die Zellen entlang der dorsal-ventralen Achse des Embryos gleichzeitig dargestellt werden. Dies ist eine deutliche Verbesserung für die Quantifizierung Zwecke, da Probleme der Lichtstreuung und Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe, die in konventionellen Z-Stapel-Rekonstruktion des längs eingebauten Embryonen tritt nun beseitigt. So ist die Quantifizierung der Genexpression oder Protein-Ebene entlang der dorsal-ventralen Achse genau, da die Zellen an den gegenüberliegenden dorsal-ventral Positionen angeordnet gleichzeitig und am gleichen konfokalen Z-Position abgebildet werden. Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Verfahren uns zu einem kompletten 2-D Bild über die dorsal-ventrale Achse von einem 3-D Embryo zu erhalten, ohne komplexe Berechnungen Abrollen Methoden, um Zellen an verschiedenen Positionen entlang der DV-Achse 6 zu visualisieren.
Einige der kritischen Schritte umfassen die Beseitigung von überschüssigen Glycerins nach dem Ausrichten Embryonen zu vermeiden, aufgeteilt zwischen den beiden Schichten von Gelee. Allerdings, wenn die Probe zu dehydriert ist, wird das resultierende Bild wird unförmig und haben falsche Morphologie. Darüber hinaus, wenn das Gelee Medium rund um den Embryo in einem Winkel, anstatt gerade geschnitten wird, kann das resultierende Bild erscheint weniger rund und mehr eiförmige Gestalt, wegen einer falschen Positionierung der Embryonen in einem anderen Winkel als 90 Grad. Schließlich, wenn das Gelee ist nicht eng genug geschnitten, um den Embryo auf der vorderen / hinteren Enden, ist es nicht möglich, ein richtiges Bild zu erhalten, weil das Ziel der Arbeitsabstand hauptsächlich verwendet würde, um in das Gelee und nicht den Embryo zu konzentrieren.
Ein weiterer wichtiger Schritt, die erforderlich sind, wenn bildgebende späten gastrulating Embryo ist sorgfältig zu sortieren Stufen von Interesse unter den Anwendungsbereich vor deren Ausrichtung. Normalerweise sind Embryonen nach morphologischen Merkmalen, die am leichtesten erkannt werden, wenn in einem Längs-Position kann in Szene gesetzt.
Unter alternative Änderungen, die mit dieser Methode gemacht werden kann, ist ein Anti-Fade-Reagenz (z. B. p-Phenylendiamin oder PPD) in die zweite Schicht von Gelee zum Schutz vor Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe gehören.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken insbesondere Deborah Harris und Danielle MacKay. Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Fakultät für Biologie und dem College of Arts and Sciences der CWRU Verfügung gestellt und durch HHMI Förderkennzeichen 52005866 zur Unterstützung von Undergraduate-Ausbildung in den biologischen Wissenschaften.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
