Summary
هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد الملون
Abstract
عدة معروفة تخلقية التدرجات والحركات الخلوية يحدث على طول المحور الظهري / البطنية من
Protocol
1. التصوير المنهجية
- تذوب الجليسرين هلام الاستحمام في 55 درجة مئوية الماء لمدة 20-30 دقيقة حتى يصبح سائلا متجانس. الدوامة ، ولكن لا يهز زجاجة لتجنب تشكيل فقاعات.
- في حين أن يذوب الهلام ، وتطبيق طبقة رقيقة من الجلسرين باستخدام Kimwipe على شريحة زجاجية نظيفة (اختياري).
- ماصة 1-1،5 مل من الجليسرين ذاب باستخدام هلام ماصة P1000 غيض قطع على سطح الشريحة لخلق طبقة رقيقة أولا. ماصة بعناية لتجنب الفقاعات.
- السماح لترسيخ هلام لمدة 5 دقائق على سطح أفقي ، ثم ضع الشريحة في -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والشروع في محاذاة الجنين. بدلا من ذلك ، مع تغطية الشريحة التفاف ساران ووضعه في درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 أيام.
- ماصة قطرة صغيرة من الجلسرين الأجنة الملون في 70 ٪ / برنامج تلفزيوني أو غيره من antifade الجلسرين وسائل الاعلام المتزايدة (على سبيل المثال أو Slowfade Vectashield) على جانب من الفراش هلام.
- تبدأ قبل محاذاة الأجنة عن طريق نقل لهم بشكل فردي من الهبوط على سطح هلام. نقلها باستخدام إبرة تحت الجلد المائلة ، وذلك باستخدام الجانب مائلة كما ملعقة.
- مكان تقريبا على طول الأجنة 2-3 الأعمدة. إذا كان الجنين يحصل عالقا في الإبرة ، وإثارة ذلك في الانخفاض الذي يحتوي على أجنة أخرى لتحريرها. لا تضيعوا الوقت مواءمة بعناية عند هذه النقطة. ترك بعض المسافة بين الأعمدة.
- محاذاة الأجنة التي ينزلق عليها أفقيا على المدى المتوسط هلام مع المعونة من الإبرة تحت الجلد. في حين ينزلق ، توجيه الرؤوس والذيول في نفس الاتجاه. جعلها موازية لبعضها البعض على طول العمود. إزالة الزائدة من الجلسرين PBS اليسار كما درب بقطعة من Kimiwipe الملتوية.
ملاحظة : الجلسرين الزائد يؤدي إلى تكون الأجنة المغطى فضفاضة داخل الجل ، مما أدى إلى انفصال طبقات هلام اثنين ، مما يجعل من الصعب خفض وجبل. على العكس ، فإن إزالة الكثير من الجلسرين الجافة وتتسطح الأجنة. - استخدام غيض قطع صفراء لانتشار طبقة رقيقة من هلام على الأجنة (50-150 ميكرولتر ، اعتمادا على كيفية العديد من الانحياز).
- الشريحة مكان في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة أو تخزينه في 4 درجات مئوية خلال الليل. تأكد من هلام جامدة تماما قبل عدة قطاعات. خلاف ذلك ، فإن كتلة من الأجنة يكون من الصعب جدا المكوس. ويتم الحصول على أفضل النتائج لقطع في اليوم التالي.
- تحت نطاق تشريح ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع تماما من خلال هلام على كلا الجانبين من أجنة الانحياز. الاستمرار على شفرة حلاقة بزاوية 90 درجة لجعل التخفيضات على التوالي. وينبغي بذل تخفيضات قريبة جدا من القطبين الأمامي والخلفي من الأجنة الزائدة لتجنب هلام التي قد تعيق التصوير.
- إضافة 100-200 ميكرولتر من PBT الباردة (4 درجات مئوية ، في برنامج تلفزيوني +0.1 ٪ توين 20) المقبل إلى خفض وكشط بعناية قبالة هلام بين أجنة باستخدام الملعقة.
ملاحظة : والمنظفات في PBT يساعد على إزالة هلام من الشريحة دون الإضرار الأجنة. - باستخدام إبرة ، ونقل كتلة من الهلام مع جزءا لا يتجزأ من الأجنة إلى شريحة نظيفة لقطع أخرى. قطع كتل صغيرة مع الأجنة 5-7. استخدام PBT من التحرك بسهولة حول الكتلة الهلامية. بدلا من ذلك ، وضع كتلة على سطح الزجاج الجافة لندعه نعلق على الزجاج ، مما يخلق المزيد من الاستقرار لتقليم بدقة وهلام ، واذا لزم الامر.
- الوجه تستقيم الأجنة جزءا لا يتجزأ من هلام مع المعونة من شفرة الحلاقة وإبرة. لتصور تحت المجهر ، والمضي قدما مع أي واحدة من الخطوتين التاليتين ، اعتمادا على نوع المجهر الوقوف المستخدمة.
- مجهر مقلوب : الانتهاء من وضع الجنين في الصعود إلى كتل ساترة طويلة ، مع الأجنة في وضع مستقيم. تأكد من أن الجانب الجنين مع أقل قدر من هلام ستكون في اتصال أوثق مع الهدف.
- المجهر تستقيم : تقديم اثنين من مداخن مع coverslips # 1 four صقها مع superglue لاستخدامه ك "يدعم" ووضع الجنين في كتلة الجلسرين في بين "تؤيد". جسر الكدسات باستخدام ساترة طويلة.
- لتحليل مبائر ، والتحقق من مسافة عمل الأهداف التي يمكن استخدامها لمعرفة ما إذا كان يمكنك صورة كل وسيلة من خلال الجنين أو جزئيا فقط. على سبيل المثال ، D. وقد الأجنة melanogaster ~ 0.55 ملم في الطول ، ويمكن تصوير تماما باستخدام زايس 20X بخطة آبو أو 40X LD الهدف النيو فلور. الموقع التالي يحتوي على معلومات عن أهداف زايس المتاحة ويعطيك الخيار للبحث الأهداف وفقا للمسافات العمل : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php
2. ممثل النتائج
لأن ترك أجنة سليمة ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لاجراء قياسات دقيقة لحجم الجنين والمسافات بين أنماط التعبير الجيني. في الشكل 1 ، ونحن أجنة تظهر مرحلة الأريمة ملطخة دابي وصمة النووي (الأزرق) ، ومكافحة الظهرية البروتين (الحمراء) ، مرنا SOG (الصفراء) والتحالف الوطني الصومالي مرنا (الخضراء). المورفولوجية بروسسSES ، يمكن مثل انغلاف من الأديم المتوسط (الشكل 2A ، B) ، والهجرة من خلايا أرومية متوسطة (الشكل 3 و 4) كما تصور أن استخدام هذا الأسلوب. ويمكن الحصول على وظائف مختلفة Z - DV على طول محور طريق تغيير الطائرة التنسيق ، كما هو مبين في الأرقام 2-4.
الشكل 1. شريحة تستقيم البصري للجنين في مرحلة الأريمة سليمة. تلطيخ مزدوج لمرنا والبروتين. يشار mRNAs هدفا لتحقيقات في الموقع (مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي) والبروتين التي اتسخت بسبب الأجسام المضادة الأولية (المضادة للالظهرية) في الشكل. كان يستخدم لتسمية دابي النوى. علما أن تقع على التعبير عن مجموعة العمليات الخاصة والتحالف الوطني الصومالي apically في السيتوبلازم ، في حين أن التعبير عن الظهرية والنووية. ويمكن أيضا إشارات قوية من النصوص SOG الوليدة الموجودة في نوى أن ينظر في هذا التكبير.
الشكل 2. تحقيقات مرنا التصوير تستقيم من الجنين سليما gastrulating. المستعملة ويشار إلى الألوان كل منها في الشكل. أ) يتم التعبير عنها لاحظ أنه في هذه المرحلة ، ثلاثة جينات ملطخة ثر نفسه (SNA ، SOG والنيابة العامة ، والأخضر) ، في مجالات يفصل مكانيا. والأديم المتوسط invaginating عن SNA ، وطبقة neuroblast عن دائرة الهجرة والجنسية والأديم الظاهر عن النيابة العامة ، في حين SOG التعبير لا تزال موجودة في مناطق البطني للجهاز العصبي. ب) في طائرة مبائر أعمق من الجنين نفسه ، نلاحظ قاعدة الأديم المتوسط invaginating بقوة عن نظام الحسابات القومية ، ولكن منطقتها القمي عن أدنى المستويات.
الشكل 3. مددت رأسي من تصوير الجنين سليما مع الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). وكانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). أ) بالقرب من الطائرة البؤري رئيس الجنين. ب) طائرة أخرى للتنسيق في المنطقة جذع الجنين نفسه. علما الشامل خلايا أرومية متوسطة قبل الهجرة الجانبية (مقارنة الشكل 4) الكذب على مقربة من خط الوسط البطني على جانبي الجنين الجرثومية الفرقة الموسعة. وصفت neuroblasts Delaminating باللون الأخضر (دائرة الهجرة والجنسية وSNA).
الشكل 4. تستقيم تصوير الجنين سليما خلال تمديد الفرقة الجرثومية SOG الحمض النووي الريبي (الأصفر) ؛ الحلزون ، الهند وmRNAs DPP (الخضراء) والبروتين الظهرية (الحمراء). أ) لاحظ neuroblasts delaminating من الظهارة (السهم) ، على حد سواء الملون للصناعات والتحالف الوطني الصومالي في هذه المرحلة (الخضراء). نلاحظ أيضا التعبير مقيدة من مجموعة العمليات الخاصة في خط الوسط بطني (الصفراء). ويمكن رؤية التعبير عن النيابة العامة في هذه المرحلة في الجانبين الوحشي للجنين (النجمة). ب) القسم البصري في الجنين نفسه يظهر في قرب نهاية طول الجنين ، وهو ما يقابل منتصف الخلفي المنطقة. هي ملطخة الخلايا البطنية خط الوسط لمجموعة العمليات الخاصة.
Discussion
يمكن التقاط صور المقطع العرضي للأجنة ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون تحديا ، لأنه يتطلب إما تشريح دقيق لجهة شرائح 2 أو استخدام وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من لتجهيز مشراح ، التي عادة ما تكون مضرة لstainings الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Z - مداخن المحرز في متحد البؤر المجهر لجعل إعادة الإعمار 3D عبر قسم الصور. ومع ذلك ، فإنه يستغرق وقتا طويلا لجعل عدة شرائح رقيقة متحد البؤر لإعادة الإعمار و 3D دقيقة وphotobleaching يصبح إشكالية. مصدر آخر للقلق عند الأجنة التصوير التي تقام طوليا هو تشتت الضوء الذي يحدث عند الوصول إلى أعمق أجزاء من الجنين ، مما يعقد أيضا أخذ قياسات دقيقة للإشارات الفلورسنت لغرض تقدير مستويات بروتين تعبير أو مرنا 1. حتى مع وجود مجهر ثنائي الفوتون مبائر ، تشتت الضوء لا يزال مصدر قلق نظرا لغموض المادة صفار في منتصف الجنين ، مما يجعل اختيار وسائل الإعلام عن تزايد الشفافية المثلى من العينة أن تكون محدودة.
للتحايل على هذه المشاكل ، وهي تقنية جديدة تسمى "النهائي على" تصوير الأجنة المواقع عموديا وضعت مؤخرا لصورة كل من يعيش وعينات ثابتة 4. في هذه الورقة ، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للأجنة عموديا الذي يسمح لإعداد تصور بسيط وثابت للأجنة أو أنسجة من أي حجم والشكل الذي هي ملطخة تحقيقات متعددة في الموضع 3. تتكون لدينا وسيلة لاستخدام وسائل الإعلام مع تصاعد الاتساق هلامي التي تستخدم لمحاذاة يغلف الاجنة في داخلها. يمكن وضع قطع من كتل هذه الوسائط التي تحتوي على أجنة متزايدة جزءا لا يتجزأ من تستقيم قبل التصوير في أي نوع من متحد البؤر المجهر.
عن طريق تضمين الأجنة في هلام ووضعهم عموديا ، ونحن قادرون على اتخاذ المقاطع العرضية الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتي تعرض الخلايا على طول المحور الظهري البطني للجنين في وقت واحد. هذا هو تحسنا كبيرا منذ لأغراض القياس الكمي مشاكل تشتت الضوء وphotobleaching من الأصباغ الفلورية التي تحدث في إعادة الإعمار Z - المكدس التقليدية للأجنة التي شنت طوليا يتم القضاء الآن. وهكذا ، القياس الكمي لمستويات التعبير الجيني أو البروتين على طول المحور الظهري البطني غير دقيقة ، حيث يتم تصوير الخلايا الموجودة في مواقع الظهري البطني العكس في نفس الوقت وعلى نفس مبائر Z - الموقف. بالإضافة إلى ذلك ، وصف الأسلوب يتيح لنا الحصول على كامل 2 - D صورة عبر المحور الظهري البطني من جنين 3 - D من دون استخدام أساليب معقدة تتفتح الحسابية لتصور خلايا في مواقع مختلفة على طول المحور DV 6.
بعض الخطوات الهامة تشمل إزالة الزائدة بعد الجلسرين محاذاة الأجنة ، لتجنب الانقسام بين طبقتين من جيلي. ومع ذلك ، إذا كانت العينة المجففة جدا ، فإن الصورة الناتجة تكون ممسوخ والتشكل وغير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم خفض متوسط هلام حول الجنين في زاوية مستقيمة بدلا من ذلك ، قد تظهر الصورة الناتجة أقل المستديرة وأكثر في شكل البيضة ، ويرجع ذلك إلى وضع غير صحيح من الأجنة في زاوية أخرى من 90 درجة. أخيرا ، إذا لم يتم خفض هلام عن كثب بما فيه الكفاية لالجنين على نهايات الأمامي / الخلفي ، فإنه ليس من الممكن الحصول على صورة مناسبة لأن تكون المسافة الهدف يعمل تستخدم أساسا للتركيز في هلام وليس الجنين.
خطوة هامة أخرى قد تكون ضرورية عند تصوير الجنين في وقت متأخر gastrulating هو فرز دقيق للمراحل ضمن نطاق الاهتمام قبل مواءمتها. عادة ، يتم وفقا لنظم الأجنة الصفات المورفولوجية التي يمكن بسهولة المعترف بها عندما تكون في وضع يمكنها الطولية.
من بين التعديلات البديلة التي يمكن إجراؤها مع هذا الأسلوب هو كاشف لتشمل مكافحة تتلاشى (على سبيل المثال ف Phenylenediamine أو PPD) في الطبقة الثانية من هلام للمساعدة في حماية ضد photobleaching من الأصباغ الفلورية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب مدينون بشكل خاص لهاريس وديبورا ماكاي دانيال. وقدم الدعم لهذا العمل من قبل دائرة علم الأحياء وكلية الآداب والعلوم CWRU ، وعبر منح عدد HHMI 52005866 لدعم التعليم الجامعي في مجال العلوم البيولوجية
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Carl Zeiss, Inc. | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | |
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | |||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisher Scientific | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| Hypodermic needles | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| Pipettes | Labnet International |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
